【原】【分子设计】同一思路，相隔19年还在发Science

分享两篇chaperone有关的分子设计。第一篇发表于2004年，是来自Howard Hughes Medical Institute的Isabella A. Graef的论文[1]。

——背景——

背景：β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）中的典型现象。

科学问题：小分子缺乏足够大的体积来破坏Aβ之间的蛋白-蛋白相互作用。

——方法——

本文提出的解决思路：设计一个双功能小分子，一部分可以结合Aβ，另一部分则可以结合chaperone，通过chaperone的大体积来破坏Aβ的聚集。

Aβ的聚集是阿尔茨海默病发病过程中的关键事件，因此抑制这种聚集可能对治疗AD有好处。然而，蛋白-蛋白相互作用（PPI）抑制剂的开发十分困难。蛋白-蛋白相互作用界面缺乏药物干预的明确“热点”，具有高度的可塑性，可以适应小分子，从而避免被抑制。

为了解决这个问题，作者提出了一种特洛伊木马（Trojan Horse strategy）策略，核心是一个双功能小分子。这个分子一端与Aβ结合，另一端chaperone与结合，通过招募chaperone来获得破坏蛋白质相互作用所需的巨大位阻（图1A）。Chaperone尤其适合这种方法，因为它们通过暴露的疏水表面结合折叠或错误折叠的蛋白质。

图1 使用双功能小分子抑制Aβ形成纤维机制示意图

在这篇工作中，双功能分子的一端与FK506结合蛋白（FKBP）结合（FKBP在所有哺乳动物细胞中高表达），双功能分子的另一端可以自由地与聚集的Aβ相互作用。许多有机化合物，包括刚果红（Congo Red, CR），都是淀粉样蛋白的配体，但这些化合物并不适合临床治疗。为了研究是否可以通过招募chaperone来增强这些原本无效的小分子干扰Aβ聚集的能力，作者合成了SLF-CR（图2），它由刚果红与FKBP的配体SLF通过共价键连接而成。

图2 SLF-CR的化学结构

——结果——

SLF-CR/FKBP（10 μM）完全阻断了能够散射光的Aβ聚集体的形成。在纳摩尔浓度下，SLF-CR/FKBP也可以延迟淀粉样蛋白聚集。SLF-CR的抑制需要FKBP，但单独的FKBP并没有改变Aβ的聚集。相反，CR是一种适度的浊度抑制剂，FKBP不会改变其效力。作者还通过硫黄素T测定法表征了SLF-CR对Aβ的聚集的影响。硫黄素T荧光在Aβ聚集体存在时增加。SLF-CR/FKBP降低硫黄素T结合物种浓度的IC50比CR/FKBP低约5倍。增加FKBP的摩尔当量进一步增强了SLF-CR的效力。在没有FKBP的情况下，SLF-CR和CR具有相似的活性。这些结果表明，药物介导的FKBP的募集是增强效力所必需的。

显微镜下观察到SLF-CR阻断了Aβ纤维形成（图3）。AFM结果显示，在SLF-CR/FKBP处理后的样品中观察到更小、更少伸长的物种；这些可能是在原纤维形成之前的中间体，这些颗粒大小大致均一，表明SLF-CR/FKBP在聚集途径中的一个独立的步骤中断了原纤维的形成；而在用CR/FKBP处理的样品中没有观察到这些物种，所以它们可能表明CR和SLF-CR/FKBP的作用机制的不同。此外，Aβ低聚物的电泳分析显示，在用SLF-CR/FKBP处理的Aβ样品中，小聚集体占主导地位。

图3 加入SLF-CR对纤维形成的影响。图A为TEM结果，图B为AFM结果

最后，作者还探索了linker对化合物活性的影响（图4）。

图4 （A）链长对活性影响的机制；（B）不同连接链的化合物结构C不同化合物对硫黄素T荧光的影响D不同化合物对纤维形成的抑制

活性最好的化合物是SLF-Benz-CR/FKBP，IC50约50 nM，比CR低40倍，并且比SLF-CR/FKBP提高6倍。TEM结果表明，不同的双功能分子处理的样品中，Aβ中间体的大小和形状相似。因此，无论Linker的性质如何，都会形成一种常见的FKBP-drug-Aβ复合物。

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第二篇发表于2023年，由Revolution Medicines公司和Memorial Sloan Kettering Cancer Center的研究人员共同发表[2]。

——背景——

背景：KRAS是一种小的鸟苷三磷酸酶（GTPase），是传统的难靶蛋白（尽管已有针对KRAS G12C抑制剂）。KRAS在非活性[鸟苷二磷酸（GDP）结合，OFF]状态和活性（GTP结合，ON）状态之间循环。活性KRAS结合并激活几种效应蛋白以调节细胞生长和增殖。KRAS突变作为致癌驱动因素，刺激过度的下游信号传导和增殖。KRAS G12C是非小细胞肺癌中最常见的KRAS突变，37%至43%的携带该变体的NSCLC患者对针对KRAS G12C非活性状态的抑制剂（如索托拉西布和阿达格拉西布）的治疗有反应。然而，两者在反应的深度和持续时间方面都是有限的。尽管这种限制的原因是多因素的，但癌症细胞似乎通过增加药物敏感性、GTP-结合的KRAS G12C的量来绕过非活性状态-选择性抑制。

科学问题：到目前为止，通过传统的小分子药物发现策略靶向KRAS活性状态的尝试一直没有成功，需要创新的方法来抑制它。

——方法——

本文提出的解决思路：雷帕霉素和FK506等天然产物可以与免疫亲和蛋白FKBP12结合，分别抑制mTOR或钙调神经磷酸酶。[雷帕霉素并不直接抑制mTOR 活性，它与FK506结合蛋白12(FKBP12)结合形成FKBP12-雷帕霉素复合物，该复合物再结合mTOR的FRB结构域，其中，雷帕霉素嵌入由 FKBP12 和 mTOR 的 FRB 结构域形成的空腔中，改变mTOR的构象，从而以变构的方式抑制mTORC1活性。因此FKBP12只是雷帕霉素介导的 mTORC1 抑制的辅助因子。由于 FRB 结构域是mTOR独有的，因此雷帕霉素对mTOR具有极好的选择性并且在纳摩尔范围内有效。雷帕霉素的衍生物的作用机制与雷帕霉素类似[3]。

受此启发，作者使用了基于结构的方法重新设计了一种双功能配体，该配体可形成免疫亲和蛋白：配体：KRAS活性态三元复合物，抑制KRAS与下游靶蛋白结合，从而阻止癌症的发生发展。

——结果——

第一个问题就是免疫亲和蛋白的选择。FKBP12是一个常用蛋白，配体也很成熟。但作者通过分析cyclophilin A (CYPA)与其配体结合的界面发现，该界面与KRAS效应结合界面上的残基具有良好的静电表面电荷互补性，而FKBP12不具备这一特征（图5）。因此本文选择了CYPA。

图5 三个蛋白的表面静电势

通过分析CYPA 的binder Sanglifehrin A（图6），将其中与CYPA结合贡献大的片段（蓝色部分）与一个Cys共价反应头组合，得到了初始化合物Compound-1，并且拿到了CYPA: Compound-1:KRAS G12C三元复合物的晶体结构。初步证明了该设想的可行性。接着通过一系列改进，优化得到了RMC-4998（图7）。

图6 Sanglifehrin A的结构式

图7 小分子结构改造的结构

通过比较CYPA: RMC-4998:KRAS G12C与CYPA: Compound-1:KRAS G12C的结构，作者发现结构优化增加了RMC-4988和CYPA之间的相互作用数量：在保持Compound-1与Q63和N102骨架的相互作用的同时，新增的吲哚环引入了与R55的阳离子-pi相互作用以及许多有利的疏水相互作用（图8）。

图8 （A）CYPA: Compound-1:KRAS G12C三元复合物结构；（B）CYPA: RMC-4998:KRAS G12C三元复合物结构

通过这些相互作用，RMC-4998重塑了CYPA的分子表面，以产生对KRAS G12C具有亲和力的新形态界面，同时，三元复合体的晶体结构揭示了实现稳定结合的几个关键相互作用。

后续的生化实验证明RMC-4988和CYPA都不能单独与KRAS G12C结合。RMC-4998在活细胞中诱导KRASG12C和CYPA之间的三复合物，而不影响野生型KRAS、NRAS或HRAS。三复合物的形成破坏了效应物与活性KRAS的结合

结构叠加表明，当结合在三复合体中时，CYPA阻断KRAS G12C的效应结合界面，包括CRAF的RBD和CRD所占据的界面、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的催化亚基（p110），SOS1催化结构域的变构位点，RAL鸟嘌呤核苷酸解离刺激因子（RALGDS）的RAS相互作用结构域（RID）等（图9）。

实验上也可证明，RMC-4998会浓度依赖性导致KRAS G12C结合蛋白的解离（图9D），且CYPA对于RMC-4998的抑制是必不可少的。值得庆幸的是，CYPA在各种癌症类型中高表达且患者间表达量变化低，并且与正常组织相比在肿瘤中表达更高。

图9 （A-C）CYPA: RMC-4998:KRAS G12C与KRAS靶蛋白二聚体的叠合；（D）随着RMC-4998浓度上升，KRAS与下游靶蛋白解离增加

最后，作者们进行了对RMC-4998进行了一系列抗肿瘤活性评价。目前该类化合物正在临床试验中。

——结果——

首先谈谈一致的点：

1. 第一篇文章中，作者通过SLF-CR招募FKBP，成功地阻止Aβ的聚集。第二篇文章，作者通过RMC-4998，阻止KRAS与下游分子的结合。两篇文章在核心思路上差别不大，都是想通过一个双功能小分子，一端与目标蛋白结合，一端与chaperone结合，利用chaperone的大体积来破坏目标蛋白的蛋白-蛋白相互作用。

2. Chaperone的配体都是天然产物/来源于天然产物。

比较明显的区别：

1. 在第一篇文章中，SLF-CR并不抑制Aβ单体的聚集，而是影响了寡聚体的组装，说明CR分子结合Aβ的位置可能并不在二聚界面上，具体的结合位点还需要结构解析。第二篇文章就确定了结合位点、结合比例、关键残基，拿到了蛋白质复合物的结构，明确了RMC-4998对CYPA结合界面的影响。

2. 在化合物结构优化的过程中，第一篇只是简单的更改了双功能分子的linker，并没有对SLF或CR进行结构优化。其实SLF（Synthesized Ligand for FKBP）本身就已经是针对FKBP优化过的配体了。第二篇的则对CYPA和KRAS G12C的配体都进行了优化。

3. 最后就是第一篇做到细胞实验层面就停止了，而第二篇的化合物已经进入了临床实验。

4. 第一篇只有三位作者，第二篇有三十六位作者。

总的看下来，第二篇比第一篇细致了很多，走的也更远，将核心想法做的更完善。在PROTAC大火的当下，希望这类双功能分子也能真正地解决实际问题。同时再次感叹，天然产物总能给药物发现提供新的惊喜。

参考文献：

[1] Jason E. Gestwicki et al. Harnessing Chaperones to Generate Small-Molecule Inhibitors of Amyloid ß Aggregation.Science306,865-869(2004). DOI:10.1126/science.1101262

[2] Christopher J. Schulze et al. ,Chemical remodeling of a cellular chaperone to target the active state of mutant KRAS.Science381,794-799(2023). DOI:10.1126/science.adg9652

[3] https://zhuanlan.zhihu.com/p/427801100