PCR常见问题

问题1：无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因：1、模板:含有抑制物，含量低

对策：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

原因：2、Buffer对样品不合适

对策：更换Buffer或调整浓度

原因：3、引物设计不当或者发生降解

对策：重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

原因：4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策：降低退火温度、延长延伸时间

问题2：非特异性扩张

现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带

原因：1、引物特异性差

对策：重新设计引物或者使用巢式PCR

原因：2、模板或引物浓度过高

对策：适当降低模板或引物浓度

原因：3、酶量过多

对策：适当减少酶量

原因：4、Mg2+浓度偏高

对策：降低镁离子浓度

原因：5、退火温度偏低

对策：适当提高退火温度或使用二阶段温度法

原因：6、循环次数过多

对策：减少循环次数

问题3：拖尾

现象：产物在凝胶上呈Smear状态

原因：1、模板不纯

对策：纯化模板

原因：2、Buffer不合适

对策：更换Buffer

原因：3、退火温度偏低

对策：适当提高退火温度

原因：4、酶量过多

对策：适量用酶

原因：5、dNTP、Mg 2+浓度偏高

对策：适当降低dNTP和镁离子的浓度

原因：6、循环次数过多

对策：减少循环次数

问题4：假阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外

          2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用
          3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

原因：引物设计不合适

对策：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性，需重新设计引物。