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小伙伴们，寒假在即，返程的车票是否已经买好了呢？什么，实验还没做完，还不知道能不能回家过年…… 不要担心，小编今天就给大家带来一些 PCR 实验中常见问题的解决方法，助力各位早日回乡探亲。 首先，我们先简单复习下：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ,PCR）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术,基本操作步骤主要包括：变性、退火和延伸。 说起来总是很简单，但是在实验中我们总会遇到各种各样的问题，下面就和小编一起看看那些年我们实验中遇到的小陷阱吧： 问题一：阳性对照有条带，而样本无结果 原因： 1. 模板含有抑制物，含量低； 解决办法： 1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量； 2. 更换 Buffer 或调整浓度； 3. 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物； 4. 降低退火温度、延长延伸时间。 问题二：非特异性扩增 原因： 1. 引物特异性差； 2. 模板或引物浓度过高； 3. 酶量过多； 4. Mg2+ 浓度偏高。 解决办法： 1. 重新设计引物或者使用巢式 PCR； 2. 适当降低模板或引物浓度； 3. 适当减少酶量； 4. 降低 Mg2+ 浓度，或更换 mix。 问题三：GC-rich（正常范围为40-60%，>60%为GC-rich）区域难以扩增 原因： GC-rich 区域需要更高的温度才能打开双链，常规的变性温度下可能解链不完全; 同时由于单链的 G+C 丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹二级结构而使 PCR 引物难以结合到模板上，DNA 聚合酶也难以延伸或延伸停止，结果出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。 解决方法： 1. 提高预变性温度或变性时间，使双链完全打开； 2. TD-PCR（梯度 PCR ）； 3. 换用热启动酶或 mix； 4. 增加 DMSO 等共溶剂，协助 DNA 变性，降低引物 Tm 值，提高产物扩增特异性。 问题四：产物在凝胶上呈 Smear 状态 原因： 1. 模板不纯； 2. Buffer 不合适； 3. 退火温度偏低； 4. 酶量过多； 5. dNTPs、Mg 2+ 浓度偏高。 解决方法： 1. 纯化模板； 2. 更换 Buffer 或 mix； 3. 适当提高退火温度； 4. 按浓度比例设置酶的添加量； 5. 适当降低 dNTPs 和 Mg 2+ 浓度； 6. 减少反应循环次数。 问题五：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染。 解决办法： 1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用； 3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 今天的干货就给大家分享到这，下面为大家着重介绍一款超级梯度 PCR 仪-NOVO G100： ■ 六个独立样品台可任意设置温度梯度； ■ 样品台之间温度跨度可达 25℃，可以设置更宽的温度范围； ■ 升温速度最快可达 5.5°C/S，达到国际先进水平； ■ 温度均匀性可达 ±0.15°C，减少边缘效应； ■ 内置计算器可进行 Tm 值计算。 |
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