干货|PCR常见问题分析

stingray928 2017-07-10

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PCR实验是我们科研中经常进行的一个实验，虽然操作简单，但有时仍避免不了各种各样的问题。今天，小编就为大家带来PCR实验中几个常见问题的分析，助您实验无忧！

PCR产物的电泳检测时间

　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带，应该怎么办？

PCR反应的关键环节有：①模板核酸的制备；②引物的质量与特异性；③酶的质量及用量；④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

出现假阳性怎么办？

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带怎么办？

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

4.1

怎样检测引物是否合成的好？

可以在DHPLC上看一下，80度全变性的情况下一条带就可以了。如果合成的不好，产物自然不特异了。

4.2

使用较好的Taq酶，且引物没有问题，则考虑：

1.模板是否过量？　　

2.退火温度是否可升高1-2度？　　

3.Mg的浓度控制在1.5mM?

出现片状拖带或涂抹带怎么办？

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。

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