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文章来源：网络科普（摘编） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，缩写PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的DNA复制。这一技术由美国Kary Mullis于1983年提出设想、1985年首先发明。台籍科学家钱嘉韵于1973 年发现Taq DNA聚合酶，为PCR技术做出了基础性贡献。 PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，它利用DNA在体外95°C时转变成单链（变性），在60°C左右时引物与单链按碱基互补配对（复性），在72°C左右时DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链（延伸）。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。截止2013年，PCR技术已经发展到了第三，它是遗传与分子生物开展科研的一个带根本性的技术手段。 PCR技术是在1980年代开始发展起来的。早在20世纪60～70年代初，科学家们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。1971年，Khorana最早提出了核酸体外扩增的设想，由于当时基因序列分析方法尚不成熟，具有较强热区间稳定性的DNA聚合酶也未发现，而寡核苷酸引物的合成处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。1983年，高速公路上的车辆流连启发美国科学家Kary Mullis脑洞大开，他于1985年发明了PCR技术，在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 最初的PCR技术相当不成熟，只是一种操作复杂、成本高昂的、中看不中用的实验室技术。1988年，Keohanog对使用过的酶实施改进，提高了扩增的真实性。随后，Saiki等人从黄石公园温泉水中的嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR扩增效率大大提高，PCR技术开始得到广泛应用。几十年来，PCR方法被不断改进，它从一种定性的分析方法发展到定量测定，从原先只能扩增几个kb（DNA的常用长度单位，指某段DNA含1000个碱基，即千碱基）的基因发展到扩增长达几十个kb的DNA片段。现在的实用PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR，等等。 DNA的半保留复制是生物进化和传代的本质性途径。生命体内的双链DNA在多种生物酶的作用下可以自然解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。实验发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP等制剂，就可以人工完成特定基因的体外复制。其中dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）是deoxy-ribonucleoside triphosphate的缩写，它是对dATP, dGTP, dTTP, dCTP等含氮碱基的统称，N代表含氮碱基，即代表A、T、G、C、U等之中的一种，它们在DNA合成以及各种PCR技术中起原料作用。 由于DNA聚合酶在高温环境下会失活，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，这样不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的发展。Saiki等人发现耐热DNA聚合同酶（Taq酶）对于PCR的应用有里程碑的意义。Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷，同时也大大降低了成本。现在PCR技术得以大量应用，并逐步应用于医学临床。 类似于DNA在生物体内的自然复制，PCR依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR技术由变性-退火（复性）-延伸三个基本反应步骤构成： ①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至90～95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合。 ②.模板DNA与引物的退火（复性）：在模板DNA加热变性成单链之后，再把温度降至50～60℃，使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 ③.引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70～75℃，以dNTP为反应原料、靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性-退火-延伸”过程，可以获得更多的“半保留复制链”。这种新链可作为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将客体基因扩增放大几百万倍。由此可见，基于聚合酶制造聚合酶链式反应的技术，其关键就在于反应物的获得及其配置和对反应温度的科学操控，通过操控变性温度、复性温度、延伸温度来实现聚合酶链式反应。如果选择到特异性和保守性高的靶基因区，并把握好技术环节，其扩增片段的特异性程度就更高。 PCR反应显示出了生物在基因遗传上的本质特性，表明引物与模板DNA之间具有特异的苟合性；碱基遵循互补配对的规律；Taq DNA聚合酶具有稳定的热区间稳定性；TaqDNA聚合酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感，它的生理活性依赖于Mg2+；靶基因具有特定的特异性与保守性。 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳技术分析，不一定要用同位素，无放射性污染，易推广。不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 PCR的产物生成量以指数方式增加，对于皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板，可以扩增到微克（μg=10-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 PCR反应的物质主要有五种：引物、酶、dNTP、模板和含Mg2+的缓冲液，它们被称为PCR反应的五大要素。 引物：PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就可以针对性地设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循： ①.引物长度为15-30bp，常用20bp左右； ②.引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段； ③.引物碱基的G+C含量在40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； ④.避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； ⑤.引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥.引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处； ⑦.引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，每条引物的浓度在0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，而且有可能导致引物之间形成二聚体。 酶：Taq DNA聚合酶目前有两种， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。 dNTP：粉呈颗粒状，溶液呈酸性，使用时先配成高浓度溶液，再以1M NaOH或1M Tris稀释，用HCL作缓冲液调节PH到7.0～7.5。多次冻融会使dNTP降解。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板：要获得模板（靶基因）核酸，通常采用SDS和蛋白酶K来纯化处理DNA标本。SDS的主要功能是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，破坏细胞膜并解离细胞中的核蛋白，它能与蛋白质结合而发生沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著影响，如果配置的Mg2+浓度不适合，将会导致反应特异性降低，出现非特异扩增。 PCR反应中的温度操控。实验经验表明，变性温度一般93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，温度过高又会影响酶的活性，如果对变性的时间、温度控制不好，容易导致PCR失败。退火（复性）的温度与时间控制还取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。比如，对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，选择55℃为最适退火温度的起点较为理想。延伸阶段的温度与时间由Taq DNA聚合酶的生物学活性所决定，一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃。 |
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