干货分享：荧光PCR法检测基因突变之PCR检测体系|PCR|引物|DNA|特异性|碱基|

主要组分选择设计

01 PCR扩增子选择

因基因突变的位置相对固定，扩增子的范围只能在突变位点上下游区域，并结合突变位点上下游区域内GC含量、SNP位点等选择扩增区域（突变位点上游还是下游），扩增子大小一般控制在120bp碱基以内，对于组织样本一般为100bp左右，游离核酸样本最佳大小是70bp碱基左右。

02 引物设计

一般选用特异性引物对+荧光探针组合（若以特异性探针扩增无需按此规则），正向特异性引物，其长度为15-30个碱基，3’末端第一位碱基为突变位置，3’末端第2-3位碱基为错配碱基，其余碱基与待测序列互补。反向通用引物，其长度为15-40，和待测序列的另一条链互补。正向特异性引物与反向通用引物间Tm值差异不超过5℃。引物合成选择PAGE纯化即可满足反应需要。

03 荧光探针

荧光探针类型不限，可以为直链探针或茎环探针等，探针的荧光基团和淬灭基团类型不限，可选用FAM、HEX、VIC、ROX、CY5、BHQ、TAMRA、MGB等；探针序列必须与待测序列或待测序列另一链互补。探针优选离正向特异性引物较近序列（距离5个碱基内最佳），且以C多于G为佳。探针合成应选择HPLC纯化方式。

04 blocker

对于特异性稍差的体系适当地可以设计添加blocker进行野生型封闭，blocker长度一般为15-40个碱基， 3’末端进行修饰（如3'-Spacer C3、3'-Phosphat、3'-ddC、3'-Inverted End等），序列与野生型模板完全互补，blocker的Tm值比引物Tm值高4-7℃，比探针Tm值低5℃左右。在合适的退火温度下，blocker优先与野生型模板结合从而阻断引物与野生模板的结合，而特异性引物可以与突变靶序列结合，从而提高PCR反应特异性。一般blocker合成选择PAGE纯化方式。

引物、探针及blocker设计基本原则如下表所示

表1：引物、探针及blocker设计基本原则

引物	探针	Blocker
20bp左右最佳	MGB探针：15-25bp（20bp左右最佳） 其他：15-30bp	15-40bp
GC% 30-70%	GC%30-80%	GC%30-80%
Tm 50-60℃ 上下游引物间Tm差不超过5℃	Tm 65-70℃	Tm 60-65℃
避免4个以上G出现	避免4个以上G出现	避免4个以上G出现
	5’第一个碱基不能为G，如果FAM信号标记，第二个碱基也不能为G
	选择C比G多的序列

05 热启动酶（含buffer、dNTP、Mg2+）

热启动PCR是除了好的引物探针设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。目前市面上最常见的热启动酶主要有抗体修饰、化学修饰和配体修饰三大类。这三种修饰在原理上有所区别，各有优劣势。一般结合酶特点及检测位点选择商业化热启动酶及配套buffer、dNTP、Mg2+（也会通过优化调整相关组分浓度）。

表2：不同修饰热启动酶对比

	化学修饰	抗体修饰	配体修饰
修饰原理	化学小分子使酶内部形成交联封闭聚合酶活性	抗体与酶结合抑制聚合酶活性	核酸适配体通过非共价键与酶结合抑制聚合酶活性
酶活性释放条件	温度：95-98℃ 时间：10-10min	温度：95-98℃ 时间：30s-1min	温度：95-98℃ 时间：30s-1min
优点	酶活性维持更稳定且无外源DNA污染，性价比较高	酶激活时间短，灵敏度高	酶激活时间短，稳定性高
缺点	酶激活时间长可能会影响酶活性	酶生产成本高，研发优化不易	可逆抑制剂，不如化学修饰稳定，特异性不够强

06 防污染系统

UDG酶及dUTP作为PCR反应体系的配制成分发挥防污染作用。作用原理是添加dUTP使PCR产物成为含有dU的DNA链。一定温度下（一般为37℃），UDG酶选择性的催化水解PCR产物中的尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架的N-糖苷键，释放出游离的尿嘧啶，形成有缺失碱基的DNA链，经95℃高温进一步水解断裂，从而消除污染，同时高温使得UDG酶失去活性，不会水解新的dU-DNA链。而样本DNA不含dU，不受UDG酶影响，继续作为PCR扩增的模板进行扩增。

图1：UDG酶防污染原理

07 反应模板

模板的质量会影响PCR扩增效率。DNA样品中发现有多种杂质会抑制Taq酶活性而影响PCR反应。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。常见有机溶剂对Taq酶活性影响如下表所示。与应注意控制PCR 反应的模板质量，以增加PCR 反应的成功率。

表3：常见有机溶剂对聚合酶活力影响

物质	浓度	活力（%）	物质	浓度	活力（%）
乙醇	<3%	100	二甲基甲酰胺	<5%	100
	10%	110		10%	82
尿素	<0.5mol/L	100		20%	17
	1.0mol/L	118	甲酰胺	<10%	100
	1.5mol/L	107		15%	86
DMSO	<1%	100		20%	39
	10%	53	SDS	0.001%	105
	20%	11		0.01%	10
				0.1%	<0.1%

08 PCR增强剂

退火温度，特异性引物探针设计和镁离子浓度等的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增。但是对于某些模板（包括高GC含量的模板以及会阻止引物结合和酶延伸的二级结构）为获得最好的结果需要模板的完全变性。此时添加一些影响DNA熔解温度的添加剂可以提高PCR特异性和扩增效率。此类PCR增强剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等在一定浓度下都可以增强PCR扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。为获得最佳结果，应优化增强剂的浓度，如果浓度不合适增强剂也会变成抑制剂，如抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油等。