增加PCR特异性:1.primers design 这是最重要的一步。理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些条件: 1)足够长,18~24bp,以保证特异性,当然,不是说越长越好,太长的primer同样会降低特异性,并且降低产量; 2)GC%,40%~60%; 3)5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性; 4)避免3'端GCrich,最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC(有人说:3'端最好是GC/CG/CC/GG。); 5)避免3'端的互补,否则,容易造成DIMER; 6)避免3'端的错配; 7)避免内部形成二级结构; 8)附加序列(RT site,Promoter sequence)加到5'端,在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构要加上它们; 9)使用兼并primer时,要参考密码子使用表,注意:生物偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用较高的primer浓度(1μM~3μM); 10)最好学会使用一种design software,PP5,Oligo6,DNA star,Vector NTI,Online design et al. *primer的另一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的primer和互补序列表现为双链DNA分子时的温度,Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下,退火温度足够低,以保证primer同目的序列有效退火。同时,还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比primer的Tm低5℃。 设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交,适用于:小于18碱基的primer。 有的是根据GC含量估算Tm。确定primerTm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基特性预测primer的杂交稳定性,大部分计算器程序使用近邻分析法。 根据所使用的公式及primer序列不同,Tm会差异很大。因为,大部分公式提供一个估算的Tm值,所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃,以2℃为增量,逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少primer二聚体和非特异性产物形成。 为获得最佳结果,两个primer应具有近似的Tm值。primer对的Tm差异如果超过5℃,就会primer在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个primer Tm不同,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃,或者,为了提高特异性,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环,然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余循环。使得在较为严谨的条件下可获得目的模板部分拷贝。 stability of primers:定制primer标准纯度对于大多数PCR应足够。 primer产量受合成化学效率及纯化方法影响。定制primer以干粉形式运输。最好在TE重溶primer,使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好,因为,水的pH经常偏酸,会引起寡核甘的水解。primer的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的primer储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的primer在-20℃可以稳定保存6个月,但在室温(15℃到30℃)仅能保存不到1周。干粉primer可以在-20℃保存至少1年,在室温(15℃到30℃)最多可以保存2个月。 PCR检测微量感染因子时,容易因为污染的而导致各种问题,因此,进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染出现。(1)划分操作区: 目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:
PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装,所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源DNA:
尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。 因此:不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意: 什么是PCR实验灵敏度?灵敏度指的是PCR扩增反应能够检测到目的基因最小值。研究结果表明,影响PCR扩增效率的因素,如,模板的复杂程度与完整性、引物纯度及其与模板结合效率、反应温度、DNA聚合酶的热稳定性与扩增性能、反应缓冲液的离子组成(主要指:阳离子)、反应优化剂等,均决定PCR实验检测灵敏度。在最佳扩增条件下,常规PCR反应能够检测到pg(10~12g)数量级目的基因。对于一个特定的目的基因,模板与引物通常都是已经限定好的因素。因此,选择什么样的PCR反应体系(包括:DNA聚合酶与反应缓冲液等)就是研究者提高PCR实验灵敏度的关键因素了。 什么是PCR实验特异性? PCR实验灵敏度与特异性是一对此长彼消特性,这也决定我们实验体系调节实际上就是需要找到适合实验灵敏度与特异性平衡点。由于PCR体系中的众多成分,使得组合较多,筛选工作繁杂。东盛基于灵敏度与特异性分别设计了PCR Mix和HS Taq Mix,帮您确定大平衡点,如果您需要更细致的平衡点,请选择相应的Mix Kit系列进行微调。 |
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