如何顺利完成你的PCR实验？

      聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

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PCR实用技巧—增加PCR特异性

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1.primers design

这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些条件：

1)足够长，18～24bp，以保证特异性，当然，不是说越长越好，太长的primer同样会降低特异性，并且降低产量；

2)GC%，40%~60%；

3)5'端和中间序列要多G/C，以增加稳定性；

4)避免3'端GCrich，最后5个碱基不要多于2个G/C；

5)避免3'端的互补，否则，容易造成DIMER；

6)避免3'端的错配；

7)避免内部形成二级结构；

8)附加序列(RTsite，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值时不算，但在检测互补和二级结构时要加上它们；

9)使用兼并primer时，要参考密码子使用表，注意生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用较高的primer浓度(1μM～3μM)；

10)最好学会使用一种design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Onlinedesign et al.

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PCR扩增重要标准—灵敏度

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      灵敏度指的是PCR扩增反应能够检测到目的基因最小值。研究结果表明，影响PCR扩增效率的因素，如，模板的复杂程度与完整性、引物纯度及其与模板结合效率、反应温度、DNA的热稳定性与扩增性能、反应缓冲液的离子组成（主要指：阳离子）、反应优化剂等，均决定PCR实验检测灵敏度。在最佳扩增条件下，常规PCR反应能够检测到pg(10^-12g)数量级目的基因。对于一个特定的目的基因，模板与引物通常都是已经限定好的因素。因此，选择什么样的PCR反应体系（包括：DNA聚合酶与反应缓冲液等）就是研究者提高PCR实验灵敏度的关键因素了。

     与实验室自配PCR扩增体系相比，东盛PCR Mix对反应缓冲液中的成分进行了优化，并加入了适当比例的反应增强剂（PCREnhancer），提高了DNA聚合酶热稳定性，显著降低模板二级结构对PCR扩增性能的影响，使得DNA聚合酶处于最适活性状态，从而获得比自配体系更高的检测灵敏度。即使反应体系中只有几个目的基因拷贝，也能轻松检测。

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PCR扩增重要标准—特异性