  多组学分析揭示了梨果实石细胞分布的差异 期刊：The Plant Journal IF：7.2 时间：2022.12 2022年12月，南京农业大学张绍铃和陶书田教授课题组在The Plant Journal上发表了“Multi-omics analyses reveal the difference of stone cell dis tribution in pear fruit Running head: Multi-omics analyses of stone cell distribution ”的研究论文。该研究收集了不同发育期的、石细胞分布有差异的部位的果肉样本，通过图像处理技术建立了梨果实中石细胞和维管束的分布模型。此外，还从转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学水平对果实核附近的石细胞形成进行了表征。揭示了石细胞中次生细胞壁木质化（SCWs）形成的合成途径，为果实育种和生物学研究提供了有价值的信息。 研究背景 石细胞是梨果实中的短核细胞，几乎全部由木质化的次生细胞壁组成。它们主要分布在果核附近，在整个果实中呈放射状分布。然而，石细胞的发育并没有得到全面的描述。在转录组学、蛋白质组学和代谢组学水平上，石细胞形成的调控在很大程度上仍然未知。 样本细则 选取砀山酥梨（DS）花后15天、35天和55天的果实，剥皮后取果肉，液氮速冻后放在-80℃冰箱保存用于组学检测。 技术路线  研究结果 1.生理生化指标：果核附近分布着石细胞和维管束 为了研究果实中石细胞的分布规律，采用红绿染色法对100个品种对花后55天（DAF）的梨进行解剖分析。图1a中选取了四个品种进行展示，包括“翠玉”、“翠冠”、“武山糖梨”和“砀山酥梨”。通过高斯滤波去噪和标签聚类提取并标记核细胞为点后，本研究观察到所有品种的大多数石细胞分布在果核附近(图1b)。经过RGB色彩空间变换发现维管束与石细胞有着相同的分布模式(图1cd)。根据k-means算法计算石细胞与维管束之间的距离，在距离维管束5 mm处，石细胞数与总石细胞数的平均比值为99.34%（图1e）。这些结果表明，梨果实的石细胞与维管束紧密相连，主要分布在果核附近。  图1 果核附近分布着石细胞和维管束 2.生理生化指标：果核附近有较高的木质素生物活性 为了进一步从生理层面表征石细胞的分布模式，作者通过比较石细胞丰富的部分(SR)和石细胞缺乏的部分(SL)，对DS的果实进行了详细分析(图2a)。如图2b所示，石细胞分布从核向外逐渐稀疏。从15 DAF到55 DAF石细胞含量迅速增加，在15 DAF时，SL和SR之间无显著差异(图2c)，在35DAF和55 DAF时，SR的石细胞含量分别比SL高4.25%和6.36%。同样，在35和55 DAF时，SR的总木质素含量分别比SL高0.27%和0.29%(图2d)。此外，木质素生物合成相关酶分析显示，在55 DAF时，SR中苯丙氨酸解氨酶PAL(42.73%)、肉桂酸-4-羟化酶C4H(41.07%)和香豆酸3-羟基化酶(C3H)(33.19%)的活性均显著高于SL(图2e-g)。SR中肉桂醇脱氢酶CAD活性也较高，在35 DAF时达到最高水平，随后下降(图2h)。但是过氧化物酶POD活性从15 DAF到55 DAF显著下降，而SL和SR之间没有显著差异(图2i)。结果表明，果核附近木质素生物合成相关酶活性较高。  图2 木质素生物合成酶的活性在果核附近较高 3.转录组分析：木质素生物合成基因在果核高表达 为了研究SR和SL的转录谱差异，本研究使用15、35和55 DAF的果实进行了RNA-seq分析。PCA分析显示SR和SL存在明显差异。本研究在转录组中鉴定了42098个基因，其中SR15和SL15有1036个差异表达基因(DEGs)。有趣的是，在35到55 DAF时SR和SL之间的DEGs显著增加(图3a)。在SR和SL三个发育时期的比较中，韦恩图分析表明，35和55 DAF果实共享大量的DEGs(1164)，而15 DAF果实与其他时期果实共享的DEGs要少得多(图3b)。通过交叉比较共鉴定出4935个DEGs。这些结果表明，转录组的变化与石细胞成熟和木质化过程的变化是一致的。 本研究进一步进行了GO富集和KEGG分析。在生物过程中，SR中上调的DEGs富集于植物型细胞壁组织、L-苯丙氨酸生物合成过程和分支酸代谢过程(图3c)。值得注意的是，SR中上调的DEGs主要富集在苯丙烷生物合成中，这与木质素生物合成密切相关。本研究鉴定出71个与木质素生物合成相关的DEGs(图3d)。一些基因在SR中转录水平明显上调，包括HCT (Pbr005360.1)、4CL(Pbr013445.1)、CCR (Pbr028834.2)和CCOMT (Pbr034039.1)(图3e)。此外，还鉴定出196个转录因子，其中110个在SR中上调，包括调控木质素生物合成的基因MYB (Pbr002014.1)、bZIP (Pbr013209.1)、WRKY(Pbr032444.1)、TALE (Pbr019805.1)(图3e)。其他木质素相关基因也被发现在SR中上调，包括己糖激酶 (HXK,Pbr036641.1)，蔗糖合酶(SUS, Pbr017514.1)，海藻糖6-磷酸磷酸酶(TPP,Pbr037395.1)和分支酸(CM,Pbr029932.1)(图3e)。综上所述，这些结果表明，木质素生物合成上调引起的石细胞次生细胞壁的木质化是由果核附近的转录因子调控的。  图3 木质素生物合成基因在果核附近上调。 4.蛋白组分析：木质素合成相关蛋白在果核附近积累 本研究进一步在15、35和55 DAF时对SL和SR的果实进行了蛋白质组学分析。PCA与转录组的PCA结果相似。本研究在蛋白质组学中鉴定出3319个蛋白， 在SR15 vs SL15、SR35 vs SL35、SR55 vs SL55中分别鉴定出188、269和215个差异表达蛋白(DEPs)(图4a)。韦恩图分析显示，各比较组中共有的DEPs数量相似(图4b)，共鉴定出590个DEPs 。这些结果也显示了SR和SL在35和55 DAF时的显著差异。GO富集分析显示，SR中上调的DEPs富集于戊糖-磷酸途径、蔗糖代谢和氧化还原过程(图4c)，这可能参与了跨分子转运和细胞壁木质化。而SR中下调的DEPs在碳固定和光合过程中富集。KEGG分析显示，SR中上调的DEPs富集在苯丙氨酸等次生代谢产物生物合成物中。与转录组的数据一致，木质素生物合成中有20个DEPs蛋白在SR中上调，包括HCT (Pbr013510.1)、CAD (Pbr026287.1)、PAL (Pbr008363.1)、CCR (Pbr022405.1)、F5H (Pbr022142.1) (图4de)。此外，SR中蔗糖代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及植物激素信号转导中的一些DEPs也上调，包括SUS (Pbr035996.1)、FDC (Pbr016162.1)、DQD/SDH (Pbr017091.1)、GalU (Pbr020146.2)、SPP (Pbr010299.1)、GID (Pbr015792.1)和CM (Pbr019996.1)(图4e)。蛋白质组学分析的结果支持了果核周围石细胞木质素生物合成增加的发现。  图6 木质素生物合成相关蛋白在果核附近积累。 5.代谢组分析：次生物质在果核周围大量合成 为了进一步研究果实发育不同阶段SL和SR中代谢物的变化，本研究使用LC-MS/MS技术进行了代谢组学分析。PCA和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)显示，SR和SL之间许多代谢产物发生了显著变化。共有88种代谢物在SR和SL中明显上调或下调，大多数在35和55 DAFs时相对含量较高(图5a)。KEGG分析显示，29种物质在次生代谢物的生物合成通路，9种在苯丙烷生物合成通路，6种在半乳糖生物合成通路，5种在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路，4种在淀粉和蔗糖生物合成通路。根据Cytoscape分析，这些途径与次生代谢产物的代谢途径和生物合成高度相关。 此外，次生代谢产物是变化最大的一组代谢产物，SR中有22个上调，14个下调(图5b)。在55 DAF时，SR中分支酸、阿魏酸、5-羟基阿魏酸、松柏醛、松柏醇和芥子醇的含量显著高于SL(图5c)。这些化合物之前已被证明参与木质素生物合成。氨基酸(SR中上调4个，下调3个)和碳水化合物(SR中上调8个，下调11个)的数量也发生了变化(图5b)。在55 DAF时，SR中棉子糖、蔗糖、D-果糖和D-葡萄糖6-磷酸的相对含量显著高于SL(图5c)。然而，在SL和SR之间，没有观察到D-山梨醇含量的显著变化(图5c)。这些化合物有可能为SCW的形成提供底物。与此相一致的是，在梨果实发育过程中，SR中检测到的苯丙氨酸含量明显更高(图5c)，它是许多酚类化合物的主要前体，包括木质素单体。这些结果在代谢组学水平上提供了证据，表明石细胞的木质化主要发生在果核附近。  图6 次生代谢产物在果核附近大量合成 6.多组学关联：转录组和蛋白质组的交叉比较 本研究整合了转录组学和蛋白质组学分析获得的信息，通过55 DAF时期的差异表达倍数来识别筛选石细胞形成的关键基因和蛋白质。本研究首先从DEGs和DEPs分析中鉴定出179个基因/蛋白，其中177个(98.88%)显示至少1.2倍的变化(图6a)。然后进行九象限图分析(图6a)，其中，121个DEPs(67.6%)与其mRNA表达水平呈显著相关，表明在石细胞形成过程中DEPs的变化主要取决于DEGs的转录水平。值得注意的是，SR中DEGs和DEPs同时上调的基因(红色部分)主要涉及苯丙氨酸和其他次生代谢生物合成。然而，SR中DEGs和DEPs同时下调的基因(绿色部分)参与了光合作用、碳代谢和谷胱甘肽代谢(图6b)。在糖酵解/糖异生中，少数基因表现出相反的模式，即在DEGs中下调，在DEPs中上调(橙色部分)，这可能是转录后或翻译后的调控。总的来说，在35和55 DAF时，许多在DEGs和DEPs分析中显示出正相关的基因参与了次生代谢产物的生物合成、苯丙类生物合成、碳代谢和糖酵解/糖异生(图6c)。这些结果可能为促进果核附近SCWs的木质化研究提供了关键证据。  图6.转录组学、蛋白质组学和代谢组学的交叉比较明确了石细胞木质化的途径 7. 多组学联合：果核附近石细胞形成的代谢途径 多组学研究可从不同角度为研究石细胞木质化提供数据参考，由此本研究整合了来自转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析的数据(图6d-g)。在蔗糖代谢中，本研究发现果糖含量的增加与蔗糖含量的增加以及转录物、蛋白质水平的蔗糖合成酶SUS和蔗糖转化酶(INV)的上调有关(图6d, e)。同样，Glc-6-P的增加与己糖激酶HXK转录物水平的升高有关。 此外，与SL相比，SR中莽草酸、分支酸和苯丙酮酸盐的丰度增加了1.1-1.7倍。预苯酸合成酶、分支酸变位酶的转录和蛋白质水平分别上调了5倍和30.5倍。L-苯丙氨酸合成酶组氨醇磷酸转氨酶(HISC)，在转录水平上也被上调(图6f)。这些结果表明，在果核附近木质素前体的合成显著增加。 木质素生物合成基因的转录物和蛋白水平均显著升高(如PAL、C4H、4CL、C3H、HCT、CCOMT、F5H、CCR、CAD、PO D)，导致相应的酚类化合物如苯丙氨酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、松柏醛、松柏醇、5-羟基阿魏酸、单醇等增加(图6g)。总的来说，本研究的多组学数据表明，在果核附近石细胞木质化的促进作用是全面的。 8. 基因功能验证实验：PbbZIP48促进细胞壁木质化和木质素的生成 为了验证多组学分析的结果，本研究筛选了DEGs，以确定控制石细胞木质化的关键候选基因。然后，本研究进行了木质素生物合成基因与TFs基因的共表达网络分析。转录因子包括与木质素生物合成基因高度相关的PbbZIP (Pbr013209.1和Pbr029860.1)、PbMYB (Pbr002014.1)和PbERF (Pbr012024.1)。有趣的是，FPKM数据显示Pbr013209.1在SR中高度表达(图7a)。Pbr013209.1是一个位于细胞核的bZIP TF，根据系统发育分析命名为PbbZIP48。 为了进一步验证PbbZIP48在梨果实中的功能，本研究对梨果实中的PbbZIP48进行了瞬时转化分析。本研究观察到PbbZIP48过表达果实的木质素含量显著增加(图7b, c)。有趣的是，本研究检测到木质素生物合成基因PbC3H1和PbCCOMT2的特异性高表达 (图7d)。在PbbZIP48过表达的烟叶中也观察到类似的结果。同时，PbC3H1和PbCCOMT2与PbbZIP48共表达，在SR中表达量更高。结果表明，PbbZIP48可通过调控PbC3H1和PbCCOMT2促进细胞壁木质化。 由于在梨中难以获得稳定的转基因植株，本研究研究了PbbZIP48在拟南芥中的功能。与野生型(WT)植物相比，三个独立的转基因株系的根和茎的生长都有所增加。在PbbZIP48过表达的植株中，木质素生物合成基因在茎中的表达均显著上调(图7e, f)。木质素含量显著增加，OE8中最高，高达38.68%。此外，解剖分析显示，过表达PbbZIP48植株茎部木质部发育发生明显变化，其中导管分子(VEs)、木质纤维(XFs)和维管纤维(IFs)次生细胞壁变厚，分别增加32.34%、34.14%和37.55%(图7i-p)。这些结果表明，PbbZIP48在拟南芥茎中SCWs的木质化中起着重要作用。 为了验证PbbZIP48是否可以直接调控PbC3H1和PbCCOMT2转录本，本研究在PbC3H1编码区上游-1085 bp和PbCCOMT2的-699 bp发现了G-box motif (5'-ACGTG-3')，它们是bZIP TF的潜在结合位点。然后，本研究使用35S: PbbZIP48作为效应器，PbC3H1和PbCCOMT2的启动子作为报告子进行双荧光素酶检测。PbbZIP48显著激活了两种启动子的相对LUC活性(图7q)。此外，使用电泳迁移率转移试验(EMSA)来确定His-PbbZIP48重组蛋白与含有来自PbC3H1和PbCCOMT2启动子区域的G-box motif的DNA探针的物理结合(图7r, s)。当PbC3H1和PbCCOMT2启动子与His蛋白孵育时，没有发现转移。 当His-PbbZIP48蛋白与探针反应时，His-PbbZIP48蛋白可以结合PbC3H1和PbCCOMT2启动子中含有G-box (AC GTG)基序的标记探针，并引起迁移率的变化。此外，加入逐渐增加浓度的冷探针有效地减少了标记探针与His-PbbZIP48蛋白的结合，PbbZIP48蛋白不能与突变探针(AAAAA)结合。这些结果表明PbbZIP48能够通过G-box (ACGTG)基序直接特异性结合PbC3H1和PbCCOMT2的启动子。总之，PbbZIP48可以通过与PbC3H1和PbCCOMT2启动子区域的G-box (ACGTG)基序结合，直接上调PbC3H1和PbCCOMT2的表达。  图7. PbbZIP48上调木质素生物合成基因表达，促进细胞壁木质化 迈维小结 在这项研究中，对分布在果核附近的石细胞及其相关维管束进行了表型分析。转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析显示，在果核附近的石细胞中，糖代谢、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的生物合成等生物过程对木质素和木质素沉积有显著的正调控作用。然后，本研究发现了许多由苯丙酸途径产生的代谢物，这些代谢物有助于果核附近石细胞的细胞壁形成。此外，还发现了一个关键转录因子PbbZIP48，该转录因子在果核附近显著高表达，并被证明可以调节石细胞中木质素的生物合成。综上所述，本研究为在多组学水平上理解梨果核附近木质化石细胞的形成机制提供了新的见解。 精彩合集，欢迎收藏
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