苯丙氨酸解氨酶（PAL）在植物中的作用及其活性测定方法

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苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化 L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，也是苯丙氨酸代谢途径的关键酶和限速酶。莽草酸途径产生的莽草酸通过分枝酸、预苯酸经转氨作用生成苯丙氨酸，从而进入苯丙烷类代谢途径，苯丙烷类代谢可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，这些中间产物可进一步转化为香豆素、绿原酸，也可以形成 CoA酯，再进一步转化为木质素、黄酮、异黄酮、生物碱、苯甲酸酯糖苷等次生代谢产物。一切含苯丙烷骨架的物质都由该代谢途径直接或间接生成。在生物次生物质代谢中具有防紫外线伤害、抵抗病原体的侵害、保持花粉生活力及形成植物花青素等多种重要作用。该酶在不同组织中、不同的内外因素调节下，含量水平及其基因表达的时空方式均有所不同。

1.PAL对植物生理代谢的意义
植物的代谢分为初级代谢和次级代谢。植物的次级代谢有多条途径，苯丙烷类代谢途径是其中很重要的一条。苯丙烷类途径生成的黄酮、异黄酮、生物碱等次生代谢产物在植物的生长发育过程中起着重要的作用，所以PAL对植物的生理意义非常重大。

1.1在木质化中的作用

在植物的木质化组织中含有较高的PAL活性。用分离的百日草叶肉细胞研究了苯丙烷类代谢酶类与木质素、管状分子形成和细胞分化的关系，发现在百日草细胞分化过程中，木质素的合成及管状分子形成与PAL 活性的增加成正相关，细胞溶质中的 PAL 活性在木质化之前迅速上升，微粒体和细胞壁的 PAL 活性在木质化期间快速增加。

1.2在植物色素形成过程中的作用
花色素是植物花朵、果实和叶片颜色的重要组成部分，花色素等的合成可由苯丙烷类产物反香豆酰 CoA 经过类黄酮途径生成，该过程与 PAL 密切相关。如苋红素是中央种子目植物所特有的色素，当用白光、蓝光或红光照射尾穗苋黄化苗后，发现 PAL 活性均有不同程度地上升，并有苋红素的积累。通过调节PAL合成基因的表达，能有效地改变了矮牵牛、烟草和菊花的花色。

1.3在植物根瘤形成中的作用
苯丙烷类代谢产物经类黄酮途径可产生黄酮类化合物，这些化合物对根瘤菌有趋化作用，有些类黄酮化合物还可作为根瘤菌结瘤基因的诱导物质。这些黄酮类物质的含量与 PAL 活性存在着密切的关系，在根瘤菌的形成过程中常伴随着 PAL 活性逐渐增强。

2.PAL在植物抗逆境中的作用

2.1参与植保素合成

植保素是参与植物防御反应的重要生理活性物质之一，主要包括酚类植保素（绿原酸、香豆素和儿茶酚等）、异黄酮类植保素（豌豆素、菜豆素、大豆素、苜蓿黄素等）和萜烯类植保素，它们能直接防止病原物的生长发育和侵染。其中，前两类都是苯丙烷类代谢的直接或间接产物，其生成量与 PAL 活性成正相关。当用 PAL 抑制剂 L-2-氨氧基-3-苯丙酸和 α-氨氧基-乙酸处理植物幼苗，植物体内植保素合成和累积受到抑制。

2.2参与木质素合成

木质素可加强细胞壁，增加组织木质化程度，形成病原菌入侵的机械屏障，木质素的合成也来自苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸。PAL 是这条途径的第一个也是最重要的酶。研究表明，在植物-病原物互作中，PAL 参与木质素合成和累积。如棉花受枯萎病菌侵染后，随着 PAL 活性提高， 出现木质素的积累。PAL 受抑制，木质素合成亦受到抑制；不同抗病性的杉木接种炭疽菌后，PAL比活力均上升，且抗病性强的杉木 PAL 比活力比抗病性弱的杉木高。

2.3参与酚类物质合成

酚类化合物也是苯丙烷类代谢产物。PAL 活性增高与酚类物质的合成亦有一致性。如感染灰霉病的黄瓜组织中，伴随 PAL 活性升高，总酚积 累；在用多糖组分处理后，提高红豆杉中酚类物质 和可溶性蛋白含量的同时，过氧化物酶和 PAL 的活性也被激活。

2.4参与抗虫过程

苯丙烷类代谢途径与植物抗虫性的报道已有很多，主要集中在这一代谢途径的产物（木质素、植保素）与植物抗虫性的关系方面。木质素的积累，可使细胞壁加厚，成为食草类动物取食的机械障碍，而植保素对草食性昆虫具有毒害作用和趋避作用，这些化合物的生成与PAL含量存在着间接的关系。许多试验证明，PAL活性高低与植物的抗虫性有很大关系，如在研究5种山羊草对禾谷缢管蚜取食的诱导性抗性机理时发现，PAL酶活提高率与蚜虫取食诱导有关，而且食草类动物的取食也可诱导 PAL 活性升高。

3.苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定

3.1原理

    PAL催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有强吸收峰，因此可通过测定反应液A290值的变化计算PAL活性。苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸的脱氨反应，生成反式肉桂酸。根据反式肉桂酸在290nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性。

3.2材料

    正常生长或经诱导处理的水稻、小麦叶片（或黄化幼苗）、马铃薯块茎等植物新鲜组织。

3.3方法步骤

（1）PAL的提取：取待测植物样品1-2g，-15℃冷冻固定后于研钵中加少量的提取介质、少量石英砂，冰浴研磨匀浆，最后用提取介质定容到10 mL，搅拌均匀，4层纱布过滤，滤液在4℃下 10000 r/min 离心15min，上清液即为待测酶液，4℃保存备用。
（2）PAL酶活性测定：取4支10mL试管（3支测定管，1支对照管），分别加入0.02 mol·L-1 L-苯丙氨酸1.0mL（对照管不加，代之为蒸馏水），硼酸缓冲液(pH8.8)2.0mL,酶液1.0mL（根据酶活性适当稀释或增加体积），总体积4.0mL。摇匀后置30℃恒温水浴保温60min，加0.2mL 6 mol·L-1 HCl终止反应，若有沉淀需过滤或离心。用对照管调零，在290 nm处检测测定管反应液的吸光度A290.
（3）以测定管反应液每小时A290增加0.01为一个酶活性单位（U）：

  式中，Vt：酶液总体积（mL）；FW：样品鲜重（g）；Vs：测定时取酶液的量（mL）;v：反应液总体积（mL）；t：反应时间（h）

3.4注意事项

（1）PAL属于诱导酶，受光（如红光）、受伤、病害感染等诱导活性增高
（2）除直接用新鲜材料提取的酶液测定外，也可将酶液用冷丙酮制成丙酮粉（可较长时间保存），然后用缓冲液溶解测定。