  上海欣软《动物行为实验手册》正在免费包邮发放中，《动物行为实验指南》是前者的进阶篇，全书预计600页+，内容更加详实严谨，印书版预计9月份完成，获取方式请关注公众号：脑声常谈的后续通知。  炎症性疼痛是临床常见的慢性疼痛，是一种复杂的多因素疾病。促炎介质的释放，如前列腺素和细胞因子可使外周疼痛神经元敏感，产生有害刺激并维持炎症。然而炎症性疼痛的病理基础尚不清楚。 细胞外三磷酸腺苷(ATP)启动嘌呤能信号的传导，是参与疼痛的生理和病理功能的必须物质。当机体受到损伤时，ATP被释放后激活嘌呤能受体P2X配体门控离子通道 3(P2X3)受体，Ca2+浓度增加导致机体对疼痛敏感，可引起外周组织炎症性痛觉过敏。P2X3在人背根神经节(DRG)的感觉神经元中高度表达。既往研究表明，P2X3 可激活NF-κ b信号通路，调节炎症细胞因子水平，并引起细胞外信号调节激酶 1/2 (ERK1/2)磷酸化而引起疼痛。同时，ERK1/2 的激活有助于 p2x3 诱导的疼痛的萌发和维持。因此，P2X3受体可能成为缓解炎症性疼痛的新的药理靶点。 黄芩(SBG)是一种多年生草本植物，具有抗炎、抗菌和抗氧化活性。传统上SBG用于治疗呼吸道和胃肠道炎症、腹部绞痛、细菌和病毒感染。现代药理学研究提示，黄芩的乙醇提取物（SGE）能增强Th1细胞及抑制Th2和Th17细胞的免疫应答，并能显著减少炎症细胞的浸润，抑制 iNOS 和 COX-2 的表达。但其缓解炎症性疼痛的作用及机制尚未深入研究。
在此背景下，2023年08月17日山西大学中药现代研究中心高丽团队在Journal of Ethnopharmacology上发文揭示了SGE对完全弗氏佐剂(CFA)诱导的炎症性疼痛大鼠的镇痛作用机制，及其缓解炎症性疼痛的作用是否通过调节P2X3受体来实现，为SGE的镇痛作用提供了依据。
图1.CFA致炎性疼痛大鼠的实验过程 首先为了了解SGE对CFA致炎性疼痛大鼠的镇痛作用，进行了第一组实验。将大鼠随机分为 6组(n=12):对照组、CFA组、CFA + SGE（1.5、3g和6g/kg）组、CFA +阿司匹林(ASA)组。将含CFA的5组大鼠右后爪间隔7天注射2次CFA 0.1 mL。在第二次注射 CFA(0d)后，CFA+SGE组大鼠灌胃分别予以 1.5、3和6 g/kg SGE，CFA+ASA组予ASA(100 mg/kg) 28 d。对照组和CFA组大鼠灌胃 0.5% CMC-Na 28 d。分别于给药前第 7 天(第一次注射前 )、第 0 天(第二次注射后 )、第7、14、21、28 天进行行为学测试。行为学实验过后处死大鼠进行后续实验。
图2.CFA联合α、β-me ATP致大鼠炎性疼痛的实验方案 为进一步探讨P2X3是否参与SGE的镇痛作用，设计了第二组实验。48 只大鼠随机分为 4 组:1.对照组2.CFA 组3.CFA + α、β-meATP组4.CFA + α、β-me ATP + SGE (6 g/kg)组。用同样方法，间隔7天注射2 次CFA 0.1 mL。经上述CFA注射后，第4组大鼠灌胃 SGE（6g/kg），其余3组予0.5% CMC-Na28 天。第28 天，第3组和第四组大鼠足底注射P2X3受体激动剂 (0.1 mL α， β-me ATP) 。分别于第1次注射前第7天、第2次注射后第0天、给予 SGE后第 7、14、21、28 天以及给予 α、β-me ATP 后第 28 天进行行为学实验。行为学实验过后处死大鼠进行后续实验。
图3.SGE可减轻CFA诱导大鼠的炎症性疼痛行为 为了评价SGE对CFA致炎性痛大鼠的镇痛作用。按照图一进行实验，分别于对应天数进行机械缩足反射阈值(PWT)、热痛缩足潜伏期试验(PWL、TWL)，转轮实验(Rotarod test)。结果显示注射 CFA后大鼠的PWT、TWL、PWL均明显降低。但予以SGE治疗后上述指标均不同程度上升。结果表明，SGE能提高炎症性疼痛大鼠的机械痛阈、热痛阈和运动协调能力。
图4.SGE对CFA诱导大鼠DRG神经元病理改变的影响 为了解SGE对cfa诱导大鼠DRG神经元病理改变的影响。图一行为学实验过后杀死大鼠，取大鼠右后爪及L4-6 DRG，取6组中大鼠的L4-6 DRG进行HE染色、尼氏染色或免疫荧光实验。结果显示：注射 CFA后，DRG神经元密集萎缩，排列不规则，染色深，尼氏小体数量明显减少。而SGE、ASA组治疗降低了DRG神经元的损伤，增加了尼氏小体的数量。结果表明，SGE对 CFA诱导的大鼠DRG神经元有保护作用。
图5.SGE对CFA诱导大鼠脚趾组织炎症因子的影响 为进一步明确SGE对CFA诱导大鼠炎症性疼痛的作用。图一行为学实验过后杀死大鼠，使用ELISA 试剂盒，检测大鼠后爪组织中的炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）水平。记录 OD 值，并根据标准曲线计算上述炎症因子的浓度。结果提示：注射 CFA 后上3种炎症因子分泌明显增加。SGE (1.5 、3和6g/kg)均能不同程度降低上述三种炎症因子的分泌，提示SGE可降低cfa诱导的炎性疼痛大鼠炎性细胞因子的分泌。
既往研究表明NF-κ b 和COX-2 的表达与炎症性疼痛密切相关，通过抑制 NF-κ b的激活可以抑制 COX-2 的释放。为进一步研究SGE对cfa诱导大鼠炎症性疼痛的作用机制。图一行为学试验后后将大鼠L4-6 DRG进行蛋白质印迹，结果显示：各组CFA诱导大鼠的DRG中 NF-kb和COX-2的磷酸化增强。而SGE治疗组可显著下调 NF-κB和COX-2 的磷酸化表达。表明SGE可以下调NF-κB和COX-2的表达。
图7.SGE对CFA诱导大鼠DRG中P2X3表达的影响 既往研究表明 P2X3 受体可促进NF-κ b 的激活，课题组为研究SGE对NF-κ b通路的抑制作用是否与P2X3的抑制有关。采用免疫荧光和western blot方法研究SGE对CFA诱导大鼠DRG中P2X3表达的影响。结果显示，注射CFA后P2X3 的表达显著增加，SGE (6 g/kg)治疗组P2X3的表达显著降低。结果表明，SGE能显著降低CFA诱导的大鼠DRG中P2X3的升高。
图8.SGE对CFA联合P2X3受体激动剂α、β me-ATP诱导的行为改变的影响 上述实验表明SGE具有缓解炎症性疼痛的功效。为进一步探讨P2X3是否参与SGE的镇痛作用。按照图2设计了第二组实验，药物注射完成后分别于对应天数进行PWT，TWL，PWL，Rotarod test，结果提示α、β-me ATP可使CFA诱导大鼠得痛阈和运动协调能力进一步降低。SGE治疗组显著增加 PWT、PWL、TWL和旋转跌倒潜伏期潜伏期。结果表明，SGE能逆转α、β-me ATP引起的机械痛阈、热痛阈和运动协调能力的降低。
图9.SGE对CFA联合α、β-me ATP诱导大鼠DRG病理改变及P2X3表达的影响 为明确SGE对CFA联合α、β-me ATP诱导大鼠DRG病理改变及P2X3表达的影响，经图二行为学实验后，取大鼠注射α、β-me ATP后的DRG，进行HE 染色，采用免疫荧光法和western blot 法检测P2X3在DRG中的表达。结果表明，α、β-me ATP对CFA诱导大鼠DRG神经元损伤更为严重，且P2X3平均强度进一步增强，Western blot 结果相似，但SGE可减轻α，β me-ATP诱导的DRG病理改变，抑制P2 X3的升高。提示SGE可通过抑制P2X3的表达来减轻炎症性疼痛。
图10.SGE对CFA联合α、β-me ATP致炎性痛大鼠足趾组织炎症因子的影响 为探讨SGE是否能抑制α、β-me ATP诱导的炎症因子的升高，测定了大鼠足趾组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。结果表明α、β-me ATP可促进上述炎症因子的分泌。但SGE可降低上述3种炎症因子的水平。结果表明，SGE可通过作用于P2 X3受体而抑制炎症因子的水平。
图11.SGE对CFA联合α、β-me ATP诱导大鼠DRG中炎性痛相关蛋白表达的影响 以上实验证明，SGE可通过抑制P2 X3发挥镇痛作用，并下调大鼠背根神经节NF-κb磷酸化和cox-2表达。抑制P2X3的表达可以下调ERK1/2的磷酸化，从而减轻机械性痛觉过敏。为了验证SGE是否通过作用于P2 X3受体来抑制NF-κB和ERK 1/2通路，根据图2实验方法，进行了western blot实验。结果显示，α、β-me ATP可使p-NF-κB、COX-2和p-ERK 1/2蛋白表达上调，SGE可使p-NF-κB、COX -2和p-ERK 1/2的表达下调。结果表明，SGE通抑制P2 X3受体抑制NF-κB和ERK 1/2信号通路。
图 12.SGE对炎性疼痛大鼠DRG中p2x3相关基因mRNA表达水平的影响 为探讨SGE对炎性疼痛大鼠DRG中P2X3受体相关基因mRNA表达水平的影响，采用 qRT-PCR方法，比较各组P2X3、COX-2、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平。结果显示，CFA及α、β-me ATP可升高上述指标mRNA表达水平。SGE能明显降低这些基因的 mRNA水平明显。结果表明，SGE 可通过抑制 P2X3 下调 P2X3、COX-2、NF-κB、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平。 综上所述，这篇文章发现SGE可以提高CFA诱导的炎症性疼痛大鼠的痛阈，改善 DRG 的病理损伤，抑制 P2X3 的表达。此外，SGE 可通过抑制P2X3受体抑制NF-κ b和ERK1/2信号通路，抑制促炎细胞因子的分泌，从而减轻炎性疼痛。  https:///10.1016/j.jep.2023.116762 特别鸣谢 |
|
|
