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1.生物信息学分析揭示了m6A修饰在宫颈癌进展中的参与 为了更好地了解m 6 A调控因子在宫颈癌进展中的作用和机制，作者首先确定了9个m 6 A编写因子（WTAP、ZC3H13、METTL3、METTL14、METTL16、VIRMA、RBM15B、RBM15和CBLL1）、15个m 6 A读取因子（FMR1、hnRNPA2B1、hnRNPC、YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、LRPPRC、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、RBMX、EIF3A和ELAVL1）和2个m 6 A擦除因子（FTO和ALKBH5），这些因子在其他人类癌症类型中已被报道具有致病作用[7, 8]。通过使用TCGA CESC数据库，作者确定了与m 6 A相关基因的拷贝数变异（CNVs）和体细胞突变，因为影响拷贝数的扩增或缺失也会影响相应基因的表达。这项分析显示，在宫颈癌中有21个m 6 A调控因子携带CNVs。在这些基因中，21个中有13个基因的突变频率为1-4%，而剩下的8个基因的突变频率为<1%。突变共存分析表明，其中一些基因也携带了与其他m 6 A调节因子的突变显著共存的突变。TCGA数据库中的RNA-seq数据进一步显示，与相邻正常组织中的表达相比，这些m 6 A调节因子在宫颈癌样本中差异表达，这表明CNV和其他体细胞突变可能导致宫颈癌中m 6 A相关基因的失调。为了确定这些m 6 A修饰模式的生物学意义，作者进行了GSVA分析，以阐明与在宫颈癌样本中鉴定出的m 6 A修饰模式相关的差异富集的KEGG通路和GO术语。结果显示，A和C簇富集了经典的癌症信号通路和过程，如VEGF、mTOR、ERBB、MAPK、Wnt、TGF-β、hedgehog和Notch通路，以及紧密连接、粘附连接、细胞周期、非同源末端连接、有丝分裂姐妹染色单体凝聚、mRNA加工和相关的GO术语，与展示B簇模式的样本相比，进一步表明了m 6 A修饰在宫颈癌进展中的参与。 2.CENPK表达与宫颈癌中异常的m 6 A修饰和肿瘤基因表达相关作者将这21个基因的差异表达数据与m 6 A甲基化数据进行了比较，这些数据可以在m 6 A-Atlas数据库中找到，并且还包括作者之前对宫颈癌患者进行的研究数据[23]，以确定在宫颈癌中可能被m 6 A修饰引起失调的特定基因。首先，作者对m 6 A簇B和C模式之间进行了差异表达分析，发现在不同的m 6 A簇中有3628个差异表达基因[折叠变化≥2.0（基因集A）；P < 0.05]。此外，m 6 A-Atlas数据库（http://180.208.58.66/m6A-Atlas/）中的实验证据表明，在HeLa细胞中有7617个带有m 6 A修饰的基因（基因集B）。随后的GSVA揭示了涉及CENPK的通路与与宫颈癌相关的m 6 A修饰簇具有最大的重叠。具体而言，CENPK富集了Wnt信号通路、DNA损伤修复信号通路、细胞周期和DNA复制等通路中的基因。根据TCGA的数据，与相应正常组织相比，CENPK在全癌症数据集中的表达水平升高。有趣的是，GSEA显示CENPK在调节铂类药物耐药性方面的作用比放射耐药性更为突出。 3.ZC3H13介导的m6A甲基化上调了CENPK mRNA的表达，从而激活了促肿瘤的功能根据作者的生物信息学分析结果，作者进一步研究了CENPK表达是否受到m 6 A RNA甲基化的调控。上述的生存分析显示了9个m 6 A调控因子（EIF3A、hnRNPC、LRPPRC、RBM15B、VIRMA、WTAP、YTHDF2、YTHDF3和ZC3H13），这些因子可能与患者的生存率较差有关。事实上，CENPK的表达与CBLL1、ELAVL1、FMR1、METTL3、METTL14、RBM15、WTAP、YTHDC1、YTHDC2和ZC3H13的表达相关。因此，ZC3H13和WTAP与患者的生存率和CENPK的表达相关，而在这两个候选因子中，CENPK与ZC3H13的表达相关性更为显著。这些结果共同证明，ZC3H13通过m6A RNA甲基化调控CENPK的表达，并且这些基因共同促进了宫颈癌的进展。
4.CENPK表达与宫颈癌病理相关为了进一步确认CENPK在宫颈癌中的核心作用，作者对119个宫颈癌样本和35个相邻正常组织进行了免疫组化分析。结果显示，与相邻正常组织相比，CENPK的表达在宫颈癌中升高。此外，CENPK蛋白的免疫组化染色显示与Ki67蛋白水平呈正相关，并且与癌症复发呈正相关。生存分析表明，CENPK表达高的宫颈癌患者的总体生存率较差。由于CENPK表达与癌症复发相关，作者进一步研究了CENPK表达与宫颈癌患者无复发生存率之间的关系。宫颈癌患者的生存分析证实，CENPK表达高是预测无复发生存率较差的一个指标，与相关性分析一致。免疫组化染色的定量分析，随后进行单变量和多变量COX风险分析，表明CENPK表达是宫颈癌患者总体生存率和无复发生存率的独立不利预后指标。 5.抑制CENPK可以抑制宫颈癌干细胞特性、化疗抗性、转移和增殖鉴于对CENPK在宫颈癌中的验证，作者试图确定CENPK如何影响细胞的干细胞特性、化疗抗性、转移能力和增殖能力。为此，作者在HeLa和SiHa细胞系中使用shRNA（sh-CENPK）或siRNA（si-CENPK）沉默了CENPK。肿瘤球形体形成实验和宫颈癌干细胞标记物（CD133和CD44）的免疫荧光染色表明，CENPK的沉默降低了HeLa和SiHa细胞的干细胞特性。克隆形成实验显示，CENPK的抑制削弱了对顺铂和卡铂的抗性，Transwell实验显示迁移和侵袭能力受损，MTT和克隆形成实验显示sh-CENPK或si-CENPK抑制了HeLa和SiHa细胞的生长。作者在BALB/c-nu小鼠中建立了宫颈癌模型，这些小鼠携带野生型或稳定沉默的CENPK，以确定CENPK如何影响体内的癌症进展。作者确认，在接受CENPK靶向shRNA治疗的肿瘤中，CENPK的表达减少了。
6.CENPK通过SOX6在宫颈癌中激活了Wnt信号通路并抑制了p53信号通路SOX6被认为通过与β-连环蛋白直接相互作用来抑制β-连环蛋白调控的靶基因的转录，从而失活Wnt信号通路[27]。此外，TOP/FOP-flash实验表明，SOX6敲除在CENPK介导的Wnt信号通路中具有调控功能。因此，这些结果暗示CENPK-SOX6相互作用可能影响SOX6与β-连环蛋白之间的相互作用。进一步的共免疫沉淀分析随后揭示了SOX6与β-连环蛋白之间的相互作用，并且在si-CENPK细胞中，CENPK-SOX6结合减弱时，SOX6与β-连环蛋白的相互作用增强。此外，免疫荧光染色和细胞分离实验表明，CENPK敲除抑制了β-连环蛋白的表达和核转位；然而，并未观察到CENPK对SOX6定位或表达的影响。 根据报告指出SOX6通过转录抑制c-Myc来增加蛋白稳定性，从而激活HeLa细胞中的p53信号通路[28]，作者随后研究了CENPK对p53信号通路的影响。双荧光素酶报告显示，在CENPK沉默细胞中p53信号通路增强，而SOX6沉默则消除了这种效应。ChIP实验表明，在HeLa和SiHa细胞中，SOX6与c-Myc转录调控区的结合增加。此外，环己酰胺追踪实验、共免疫沉淀分析和细胞分离实验均证实，CENPK沉默导致p53稳定性增加，抑制p53泛素化和核外转运，而这些效应均被SOX6沉默逆转。这些数据表明，SOX6介导了CENPK对Wnt和p53信号通路的影响。 7.CENPK通过Wnt和p53信号通路促进了宫颈癌细胞的肿瘤形成功能作者随后调查了CENPK在宫颈癌中是如何通过Wnt和p53信号传导来发挥作用的。免疫荧光染色、肿瘤球形体形成、克隆、MTT和EdU实验共同显示，β-连环蛋白过表达或p53沉默逆转了CENPK沉默对HeLa和SiHa细胞中细胞干性、化疗抗性、迁移、侵袭和增殖的抑制作用。免疫荧光染色和Western blot进一步显示，β-连环蛋白过表达或p53沉默消除了CENPK沉默对DNA损伤修复、细胞干性、EMT和DNA复制相关基因表达（即γ-H2AX（Ser139）、p53、p21、c-Myc、Vimentin、CCND1和c-Jun）的多样效应。 至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：作者首先详细地探讨了N6-甲基腺苷（m6A）RNA甲基化在宫颈癌进展中的重要性；第二部分描述了通过生物信息学分析发现的m6A修饰模式与宫颈癌预后之间的紧密联系；第三部分深入分析了ZC3H13介导的CENPK mRNA的m6A修饰及其在宫颈癌中的作用；第四部分叙述了CENPK在宫颈癌中的癌基因作用，以及其作为宫颈癌治疗的预后指标和新的治疗靶点的潜力。全文内容详实，为作者揭示了RNA甲基化在宫颈癌中的关键作用，为生物信息学和宫颈癌研究提供了新的研究方向，对于研究宫颈癌的朋友们来说是一篇不容错过的好文章！ |
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