《Nature》：揭示了染色体不稳定性和表观遗传改变之间的关联性

具有染色体不稳定(Chromosomal instability，CIN)的癌细胞的一个标志是存在滞后的染色体，错失分离的染色体经常最终进入微核，其包膜容易破裂，将其基因组内容物暴露在细胞质中。这种破裂引起的广泛DNA损伤可以催化基因组异常，染色体不稳定和表观遗传改变是晚期和转移性癌症的特征，但它们是否存在联系尚不清楚。

2023年6月7日，发表在《Nature》杂志上的一篇题为“Epigenetic dysregulation from chromosomal transit in micronuclei”的文章，发现了微核中染色质可及性的改变会导致可遗传的表观遗传缺陷，最终导致细胞核中染色体出现可遗传性的异常调控。

首先，为了确定微核中染色体隔离对表观遗传学的影响，作者使用免疫荧光显微镜来评估人非转化乳腺上皮细胞 (MCF10A)、端粒酶永生化视网膜色素上皮细胞 (RPE-1)、高级别浆液性卵巢癌 (HGSOC) 细胞 (OVCAR-3) 以及人和小鼠三阴性乳腺癌细胞 (MDA-MB-231 和 4T1) 中典型组蛋白 PTM 的状态。在比较原核和微核时，观察到组蛋白 PTM 分布的显着差异。微核沿组蛋白 H3 尾部的多个残基（H3K9ac、H3K27ac 以及较小程度的 H3K14ac（仅在肿瘤细胞中丢失）的转录激活标记赖氨酸乙酰化减少。此外，组蛋白上的两个典型泛素化位点。无论微核形成的基础速率如何，微核中组蛋白 PTM 模式的变化在非转化细胞和癌症衍生细胞之间以及跨物种之间都显着保守。尽管组蛋白H3上的一些重要的赖氨酸甲基化事件保留在微核中，但其他赖氨酸甲基化事件，例如H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3，却被富集。用泛组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂伏立诺他治疗导致微核中H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac信号几乎完全恢复，而用EZH2抑制剂GSK126治疗导致H3K27me3染色强度降低。组蛋白 PTM 的这些变化表明组蛋白修饰酶的平衡发生了改变，其中许多酶被发现在微核中不存在。此外，观察到与原核相比，微核中 RNA 聚合酶 II 亚基 B1 (RPB1) 的磷酸化降低，表明转录活性降低。接下来，作者从 MDA-MB-231 和 4T1 细胞的微核中纯化并分离初级核。对微核中典型组蛋白 PTM 的定量质谱证实，与原核相比，组蛋白 H3 和 H4 上多个赖氨酸残基的乙酰化减少。总体而言，组蛋白标记的分布和水平在初级核和微核之间显着不同。免疫印迹分析证实微核中两个单泛素化标记（H2AK119ub 和 H2BK120ub）均丢失。与在细胞系中的结果一致，在 16 个人类 HGSOC 样本的微核中， 与 H3K27ac 相比，微核中的 H3K27me3 得到了相对保留。

图1. 微核中不同组蛋白的 PTMs

接下来，为了测试组蛋白 PTM 的异常是否是由微核包膜破裂引起的，作者将组蛋白 PTM 与 cGAS（一种胞质双链 DNA 传感器）共染色。缺乏组蛋白 H3 乙酰化的微核（K9ac、K14ac 和 K27ac）和 H2AK119ub 更有可能表现出 cGAS 共定位。这种现象仅限于微核，因为通过耗尽核纤层蛋白 A 诱导原发核破裂不会改变 H3K27ac 染色强度。在人类 HGSOC 中，cGAS 染色的微核中 H3K27ac 广泛缺失，而 H3K27me3 略有减少。与细胞系相比，在保存的人类肿瘤样本中检测组蛋白 PTM 的灵敏度降低。用伏立诺他（vorinostat）处理MDA-MB-231细胞恢复了所有微核中的组蛋白H3赖氨酸乙酰化。

图2. 微核破裂和染色体错聚改变了微核中组蛋白的翻译后修饰

接下来，为了测试组蛋白 PTM 分布的异常是否会改变微核中的染色质结构，作者使用了三种正交方法，从荧光寿命成像显微镜 (FLIM) 开始，它可靠地识别了原代核中的常染色质和异染色质区域。完整微核中的染色质是致密的，类似于异染色质。破裂微核中的染色质在 MDA-MB-231 细胞中是致密的，但在 4T1 细胞中表现出广泛的分布。由于胞质核酸酶部分消化了 DNA，CRISPR-Cas9 介导的核酸酶基因敲除Trex1消除了4T1细胞中破裂微核的信号异质性。接下来，用装载有荧光团标记接头的转座酶处理 MDA-MB-231 细胞，以亚细胞分辨率对染色质可及性进行成像，这种技术称为可视化转座酶可及性染色质测定（ATAC-see）。ATAC-see 荧光信号在微核中显着减弱，但当细胞用 EZH2 抑制剂或 HDAC 抑制剂处理时恢复。对原代核、完整微核和破裂微核进行了 ATAC 测序（ATAC-seq）和全基因组测序（WGS）。基于样本合并峰 ( n  = 14,676) 的主成分分析表明，原核以及完整和破裂微核之间的整体染色质可及性存在差异。微核和初级核表现出大量差异可及的峰，这不能用微核中相关基因组区域的任何过度或不足来解释。基因集富集分析（GSEA）显示，与初级核相比，在微核中优先进入的基因参与染色质和组蛋白修饰、RNA生物发生和加工以及蛋白质周转。相反，微核中不易获得的基因与发育途径、细胞粘附和迁移有关。令人惊讶的是，微核中染色质可及性的差异涉及深刻的位置偏差。虽然许多转录起始位点 (TSS) 在微核中更容易接近，但非 TSS 峰则不太容易接近。更深入的位置分析揭示了对更容易接近的启动子及其在微核中的相关基因体的压倒性倾向，这在高转录和低转录基因中是一致的。相比之下，内含子和远端基因间区域的可及性降低。研究了启动子可及性的意外差异是否可以通过 H3K4me3 的异常沉积来解释，H3K4me3 标记转录活性启动子，并且在微核中生化富集。CUT&RUN分析揭示了微核中H3K4me3的相对富集与ATAC-seq信号强度的相关变化之间呈正相关。进一步分析确定了微核中H3K4me3差异富集的四个簇，其中一簇（簇1）表现出微核中启动子区域附近H3K4me3沉积增加以及染色质可及性相应增加。

图3. 微核中染色质的可及性发生了改变

随后，为了确定微核中染色质可及性的变化是否反映了染色体不稳定细胞的全局表观遗传景观，使用kinesin-13蛋白 MCAK 的活性和显性失活形式，生成了具有不同 CIN 水平的 4T1 细胞对。这些异源细胞对含有不同比率的染色体错配和微核。在微核中比原核更容易接触到的区域，在 CIN 高的肿瘤细胞中也比在 CIN 低的肿瘤细胞中更容易接触到。反之亦然。在对基因组的 TSS 区域进行相同分析时，这一趋势保持一致。作者通过比较癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）中基因组改变率（FGA）最高和最低的三分之一的人类乳腺肿瘤，检验了在微核中比原核中更容易获得的基因是否在有 CIN 的人类癌症中转录富集。在FGA高的肿瘤中，可获得微核的基因有明显的转录富集。同样，相对于 FGA 低的肿瘤，FGA 高的肿瘤中较少可进入微核的基因的转录本也相应减少。

之后，对对照组和表达层粘连蛋白-B2 的染色体稳定的 TP53 基因敲除 RPE-1 细胞接受亚致死剂量的逆转录素长期处理（约 2 个月 8 次传代），逆转录素是一种能诱导染色体分离缺陷的 MPS1 抑制剂。经逆转录病毒处理的细胞在无丝分裂期染色体错聚、微核形成以及普遍存在的染色体数目和结构畸变均有所增加，表明存在 CIN。在逆转录素最后一次处理 48 小时后进行了 WGS、ATAC-seq 和 RNA 测序 (RNA-seq)，观察到染色质可及性和转录的总体变化，这也无法用基因组拷贝数改变来解释。

Lamin B2 本身不会对染色质结构或转录产生有意义的影响，但它可以部分缓解逆转录酶诱导的一些变化。在逆转录素处理的细胞中，启动子区域的可及性增加。通常在微核中更容易表达的基因在逆转录素处理的细胞中也有转录富集，而那些在破裂的微核中只容易表达的基因在板层片 B2 过表达时则相应下调。许多差异表达的基因属于致癌或肿瘤抑制通路，用反转录因子处理 RPE-1 细胞会上调致癌转录程序，而过表达片层蛋白 B2 则会挽救这些程序。接下来，对逆转录素处理的 RPE-1 细胞进行了 CUT&RUN，分析了与 H3K4me3、H3K27me3 和 H3K27ac 结合的染色质。H3K4me3富集在经逆转录素处理后变得更易接近的染色质峰中，而 H3K27ac 则在板层片段 B2 过表达后相应地富集在易接近的染色质峰中，这些染色质峰的易接近性因逆转录素而增加，但同时又因板层片段 B2 过表达而得到修复。为了检查 CIN 诱导的表观遗传异常是否特定于微核中转运的染色体，使用了三种正交方法。从可诱导的 Y 染色体特异性错误分离系统开始，作者分离了单细胞衍生的克隆，其中 Y 染色体在微核后已稳定地重新整合到原代核中。通过对亲本细胞以及 14 个克隆进行 WGS、ATAC-seq 和 CUT&RUN（H3K4me3-、H3K27me3- 和 H3K27ac 结合染色质），能够评估与其余正常常染色体以及亲本系相比，每个克隆中错误分离的 Y 染色体所特有的长期表观遗传后果。将沿基因组的 ATAC-seq 读取计数标准化为从每个克隆的 WGS 获得的 DNA 拷贝数。相对于亲本细胞，Y染色体中拷贝数校正的可及性谱和组蛋白标记分布的克隆间变异性增加，但常染色体或X染色体中则没有。各个克隆中 Y 染色体上 10 千碱基 (kb) 长的基因组片段的染色质可及性差异也大大超过了常染色体和 X 染色体。重要的是，ATAC-seq 信号异常与染色体断裂或重排无关。尽管染色质可及性变化没有一致的方向性（即，与亲本系相比，一些克隆在Y染色体的同一基因组区域中表现出可及性增加，而其他克隆则表现出可及性降低），但ATAC-seq信号的偏差反映了单个克隆中H3K4me3和H3K27ac（但不是H3K27me3）占用率的相应变化。

图4. CIN 驱动染色质可及性的长期变化

最后，利用核糖核蛋白转染 CRISPR-Cas9 单导 RNA 复合物，在 TP53 基因敲除的 RPE-1 细胞中以 4 号染色体为目标，诱导部分染色体错分离。在该系统中，4号染色体的一部分经历了微核化，并且形成的大部分微核包含4号染色体遗传物质。生成的两个克隆经历了 4 号染色体错误分离部分的自发重新整合，因此包含部分 4 号染色体拷贝数改变：4p 和 4q 臂内的三体性。在第二个克隆中，18 号染色体也存在自发三体性。作者分析了 4 号染色体上染色质可及性的拷贝数标准化变化，并观察到与具有非靶向指导的对照克隆中的相同区域相比，仅限于两个克隆中的每一个中发生错误分离的部分（以及克隆 2 中的 18 号染色体）的异常。这包括发生错误分离的 CRISPR 诱导断点一侧的 ATAC-seq 信号异常，如 ATAC-seq 峰的出现或消失所示。这些结果表明在连续的细胞分裂过程中微核的持续形成和重新整合稳定地导致了表观遗传异常，促进了细胞间染色质可及性的变异性。

图5. 微核中的染色体转运促进可遗传的表观遗传异常

总之，本研究结果表明微核中染色体的短暂隔离会破坏染色质组织，导致在染色体重新整合到初级核中很长时间后，导致可遗传的表观遗传失调。因此，CIN 可以通过在单个细胞周期内改变整个染色体的染色质组织来驱动癌症中的表观遗传重编程，改变细胞周期中染色质可及性等特征，这些为癌症细胞中表观遗传变化以及异质性提供了来源。