 导语 今天给同学们分享一篇肿瘤+预后模型+实验的生信文章“An Angiogenic Gene Signature for Prediction of the Prognosis and Therapeutic Responses of Hepatocellular Carcinoma”，这篇文章于2023年2月7日发表在Int J Mol Sci期刊上，影响因子为5.6。  在全球癌症相关死亡中，肝细胞癌（HCC）排名第二。大多数HCC的高血管特征凸显了血管生成在治疗中的重要性。本研究旨在确定能够表征HCC血管生成分子特征的关键基因，并进一步探索改善患者预后的治疗靶点。 1. 基于肝癌血管生成相关基因的预后模型构建 作者分析的第一步是对TCGA和ICGC队列进行单变量Cox回归。在TCGA和ICGC队列中，分别确定了3101个和917个基因与HCC生存相关。与血管生成相关的基因集相交后，确定了32个与HCC预后相关的血管生成相关基因（图1A）。然后，作者使用LASSO回归分析筛选出了29个特征基因（图1B、C）。在TCGA队列中使用这29个基因进行多变量Cox回归分析后，确定了14个ARPGs作为最佳特征基因集，并显示了危险比值（图1D）。通过HPA数据库，作者发现TPX2、KIF4A、BCAR3和YWHAG在HCC组织中的水平较高，而RAB11A、GOT2、KDR、ATF3和SLC22A1在正常肝脏组织中的水平较高（图1E）。通过热图可视化了22个HCC细胞系中14个ARPGs的表达水平。作者还通过qRT-PCR测试了两个HCC细胞系的mRNA水平。从这两个图中可以看出，这些基因在HCC细胞中的表达水平是一致的。绘制了TCGA-LIHC队列的热图，以测试肿瘤组织中14个ARPG的表达水平。  图1 预后标志物的构建 2. 预后模型的验证 为了确认结果，该模型还使用了一组独立个体进行了进一步验证。Kaplan-Meier生存分析显示，在TCGA训练样本（图2A）和GSE14520验证样本（图2B）中，低风险评分的样本的生存时间比高风险评分的样本更长。ARPGs风险评分模型在训练和验证过程中使用了时间相关的ROC曲线和曲线下面积（AUC）进行了测试（图2C、D）。在1年、3年和5年的时间点上，TCGA数据集的AUC曲线超过了0.76，GSE14520数据集的AUC曲线超过了0.63。这表明该模型在整个患者随访期间具有良好且稳定的预测价值。随后，作者根据风险评分对训练和验证集进行了排名（图2E、F）。结果表明，风险评分较高的HCC患者的生存时间较差。  图2 3. 通过该基因集的风险模型预测的风险 作者构建了一个图表，用来简单计算ARPG风险评分的十四个标记物，并大致预测HCC的1年、3年和5年生存率（图3A）。结果显示，图表预测的1年、3年和5年生存率与最佳预测性能非常接近（图3B-D）。作者比较了正常组织和HCC组织中这14个ARPG的表达水平。箱线图（图3E）暗示它们也可能作为HCC的诊断生物标志物。  图3 在肝细胞癌(OS)预测中构建一个刻度图 4. 高风险组和低风险组体细胞变异的比较 目前尚未发现可用作免疫疗法敏感性预测分子的生物标志物。肿瘤突变负荷（TMB）有潜力对免疫疗法产生良好反应。有研究显示，与常规化疗相比，高突变负荷的非小细胞肺癌（NSCLC）患者，无论PD-L1表达水平如何，一线奈伐单抗联合伊匹单抗可延长无进展生存期（PFS）[9]。因此，突变越多，新抗原中有免疫原性的可能性就越高，这就是为什么T细胞会清除它们[10]。作者首先研究了肝癌中突变率最高的前八个基因在两组之间的差异（图4A）。变异分类也通过堆叠条形图和箱线图总结了变异类型和变异数量（图4B）。在所有变异分类中，错义突变排名第一，而单核苷酸多态性（SNP）的发生率远高于其他类型的突变在HCC中。通过小提琴图，作者可以发现高风险组的TMB数量高于低风险组（图4C）。两组之间的六个差异突变基因是CTNNB1、P53、TTN、ALB、MUC16和PCLO（图4D）。在低风险组中，CTNNB1突变更为主导，并且一些研究表明CTNNB1突变的HCC具有良好的分化程度。TP53已被确定为HCC某些分子特征的生物标志物和不利生存预后的预测因子，根据作者的结果，高风险个体中TP53突变更为更常见（图4D）。突变分析的数据表明，高风险患者可能更适合免疫治疗。  图4 分析不同风险组之间的体细胞变异 5. 分析模型的功能富集分析 将343个TCGA样本根据其中位风险得分分为两组。制作了一个火山图，展示了这两组之间的所有差异表达基因(DEGs)。结果发现，在高风险组中有1077个基因上调表达，而有275个基因显著下调(Figure 5A)。为了更好地了解14-ARPG的调控效应，作者在Metascape中输入了上调基因的前500个基因，获得了一个蛋白质相互作用(PPI)网络。此外，作者从PPI网络中提取了五个最有意义的MCODE组件(Figure 5B)，包括GPCR配体结合、snRNA加工和电压门控钾通道，这些与生物功能相关。为了探索与14-ARPG相关的潜在生物过程，作者使用这些前500个差异表达基因(Padj ≤ 0.05)进行了GO分析(Figure 5C)。考虑到14基因标志与一些重要的信号通路，作者应用GSEA分析来寻找相关的通路。Reactome通路数据库富集结果显示，真核生物翻译延伸、姐妹染色单体凝聚的解离、动力蛋白、真核生物翻译起始、前复制复合物的激活以及DNA解旋等通路富集显著（图5D）。总结起来，作者发现高风险组和低风险组之间主要存在与细胞周期相关的生物差异。  图5 ARPGs的相应调控网络 6. 构建基因特征标志 根据上述研究，作者的模型风险评分与HCC患者的预后显著相关。在HCC患者中，临床因素如AJCC分期和年龄仍然是OS的重要预测因子。因此，作者将这些经典风险因素与作者的14-ARPG整合，制作了一张图表，以开发一种有效的方法来预测HCC的OS（图6A）。通过对这些变量的所有分数求和，可以计算出患者的总体评分，基于此评分可以估计1年、3年和5年的存活率。作者还构建了一条一年的ROC曲线，以比较作者的模型与其他传统临床数据（图6B）。作者的模型的AUC为0.770，显著高于其他模型。作者通过三个校准曲线验证了这个图表，其中45°线代表最佳预测。校准曲线表明，作者的图表在1年、3年和5年的HCC OS预测方面表现良好（图6C-E）。通过探索风险评分与临床数据之间的关联，作者发现不同肿瘤分期的HCC患者之间的风险评分差异显著（图6F、G）。患有肝细胞癌的患者可以使用ARPGs的风险评分来预测肿瘤的分期。  图6 构建预测预后的等高线图 7. 不同群体对靶向治疗和免疫疗法的敏感性差异 在验证模型在预测诊断和预后方面的性能后，作者尝试预测高风险患者的治疗选择。GSE109211包含了21个索拉非尼治疗反应者和46个接受索拉非尼治疗但无反应者，作者计算了他们的风险评分以检查索拉非尼反应是否与他们的风险特征有关。作者的模型中有8个基因在两组之间表达差异明显（图7A）。此外，在索拉非尼治疗反应者中，风险评分显著高于无反应者（p ≤ 0.001）。这表明高风险评分的肝细胞癌患者可能对索拉非尼更敏感（图7B）。免疫检查点抑制剂的疗效受表面表达水平的严格限制，因此作者使用TCIA数据库（https:///home，于2022年1月1日访问）分析了风险评分与免疫检查点抑制剂治疗效果之间的关联。基于四种免疫相关基因的免疫细胞组合开发的IPS在接受CTLA-4和PD-1抑制剂治疗的患者中具有预测价值。低风险组的IPS和CTLA4评分显著较高（p ≤ 0.05) 提供证据表明，具有低风险评分的LIHC样本可能适合免疫治疗（图7C，D）。  图7 HCC患者治疗反应的预测 8. 基于模型的潜在药物预测 在下一步中，作者寻找可能适用于高风险患者的潜在药物。通过DEPMAP数据库对TCGA队列中的1448种化合物的AUC进行估计后，作者对风险评分和AUC进行了相关性分析。然后，作者总结了与风险评分呈最强负相关的前十种化合物（图8A）。Crizotinib是一种通过抑制间变性淋巴瘤激酶（ALK）和c-ros癌基因1（ROS1）来治疗抗癌药物，已经获得了治疗非小细胞肺癌的批准。作者还比较了不同组中Crizotinib预测AUC的分布，并发现高风险组对Crizotinib的整体敏感性更高（图8B）。接下来，作者通过Transwell实验确认了Crizotinib在HUVECs中的抗迁移能力（图8C）。作者观察到Crizotinib降低了HUVECs的管状形成能力（图8D）。此外，Crizotinib还可以增加PLC/PRF/5和MHCC97H细胞系中的凋亡水平（图8E）。然后，在C57小鼠中建立了皮下肿瘤模型，并用Crizotinib进行治疗。Crizotinib可以显著抑制肿瘤生长速率和重量（图9A、B）。皮下肿瘤的免疫组化染色显示，增殖标记物KI67和血管标记物CD31在Crizotinib的作用下显著受到抑制（图9C）。  图8 高风险群体潜在靶点的预测  图9 活体内对Crizotinib治疗肝癌的实验 总结 总之，作者的研究确定了与血管生成相关的基因，这些基因对于肝细胞癌的预后至关重要。此外，这个包含14个mRNA的预测标志在不同亚型的患者中仍然具有显著意义。这个模型似乎有助于肝细胞癌患者的个体化管理。 |
|
|
