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溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因不明的慢性复发性炎症性疾病，其不易治愈，并且是结肠癌的主要致病因素[1]。UC的急性发作会引起脱水、脓毒症甚至休克，严重威胁患者的生命安全[2]。UC会损害肠黏膜屏障，导致肠道微生物和内毒素通过肠黏膜侵入，引起全身炎症反应综合征甚至多器官衰竭[3]。在UC中，白细胞介 6(interleukin- 6，IL- 6)会激活STAT3，进而引起炎症细胞因子的转录和表达，进一步加剧炎症破坏肠黏膜屏障[4]。金荞麦是一种双子叶科蓼科的多年生草本植物，具有清热解毒、排脓去瘀之功效[5]。临床上，金荞麦片主要用于治疗急慢性呼吸道疾病，或者细菌性痢疾[6]。近年来有研究发现金荞麦可以缓解UC患者的炎症反应[7]，但是金荞麦治疗UC的证据仍不明确，并且尚未发现金荞麦治疗UC作用机制的报道。因此，本研究基于IL- 6/STAT3通路分析金荞麦对急性UC小鼠肠黏膜的影响，为金荞麦临床治疗UC提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
C57BL/6小鼠(SPF级，雄性，4周龄，成都达硕实验动物有限公司，中国)。乙酸(Sigma公司，美国)。葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS)(相对分子质量：36 000～50 000；MP Biochemicals，Solon，美国)。金荞麦片(Z2302003，康麦斯药业，中国)。果糖(lactulose，L)、甘露醇(mannitol，M)和蜜二糖(Sigma公司，美国)。HE染色试剂盒(Roche公司，美国)。TRIzol和RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN GmbH公司，德国)。SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa公司，中国)。PCR仪(ABI7900，ABI公司，美国)。Z 1一抗、Occludin一抗、I 6一抗(ab229381)和STAT3一抗(ab68153)(Abcam公司，美国)。PVDF膜(Millipore公司，美国)。ECL 显色试剂盒和Nanodrop 2000仪器(Thermo Fisher公司，美国)。
1.2 建模、分组和处理方法
将小鼠饲养在温度为20～25 ℃、相对湿度为55%～65%的环境中，12 h/12 h敏感交替，自由饮食和饮水。将45只小鼠分为对照组、UC组、UC 金荞麦片组(每组15只)。根据文献[8]，在适应性喂养1周后将3%的DSS加入到饮用水中连续1周来诱导UC急性反应。UC 金荞麦片组小鼠使用金荞麦片水溶液(32 mg·ml-1)灌胃，剂量为0.02 ml·g-1[9]，每日1次，连续7 d。
1.3 检测指标和方法
1.3.1 疾病活动指数 观察各组小鼠体质量变化、粪便黏稠度和粪便隐血，每项总分4分，疾病活动指数为3项得分之和，得分越高提示UC越严重。
伊德里斯著作中提及的早期地理学家包含八世纪的波斯地理学家伊本·胡尔达兹比赫，九世纪亚美尼亚人地理学家艾哈迈德·本·雅库布 (al-Yaqubi)，十世纪的基督教修士埃尔西奥·安蒂奥士，十世纪的阿拉伯地理学家豪盖勒 (Ibn Hawqal)和马苏第和《珍异记》，克洛德(Claude)家族的托勒密。 [13]伊德里斯的地理学知识主要来自两个传统：希腊托勒密的地理学传统和早期伊斯兰地理学的巴勒希学派 (见图2)。
1.3.2 结肠长度 小鼠颈椎脱臼后安乐死，取出整段结肠测量结肠长度。
这房子在旷野里，才会这么冷，青梅居的九楼，也有从旷野里吹来的风雪，青梅居会冷吗？应该不会的吧，那新建的房子，不是吹嘘有外墙保温系统吗？即使没有，新建的楼房，密封也好，怎么会任由这北风呼呼地吹进来又呼呼地吹出去？李倩倩、弟弟和妈，此刻都睡在那栋房子里，他们都不会感觉到寒冷。
写话教学是作文教学的启蒙阶段，是作文教学的重要基础。低年级学生阅读面窄，语言积累不足，生活经验缺乏，这些导致学生写话能力发展较为缓慢。因而，我们在语文阅读教学中，重视语言的积累以及语言文字的训练，更能有效地促进学生写话能力的提高。因此抓好小学低年级学生说话和写话的训练，是提高学生作文能力的基础环节。
1.3.3 HE染色 结肠组织用10%甲醛溶液固定48 h，流水冲洗。不同浓度的乙醇脱水，然后将组织浸入蜡中，并切成 5 μm 的厚度。将载玻片置于 65 ℃ 恒温烘箱中30 min。脱蜡水化后染色。细胞核用苏木精染色5 min，细胞质用伊红染色1～2 min。染色切片用纯酒精脱水并在显微镜下观察拍照。
㉚ Sonia Maffei（Cura e Commento），Cesare Ripa’Iconology(1603)，testo stabilito da Paolo Procaccioli Pubblicazione,Torino,Einaudi,2012.
1.3.4 ELISA 裂解小鼠结肠组织，离心(4 ℃，20 min，12 000 r·min-1)后使用移液枪小心吸取上层清液，加入抗体孵育2 h后加入显色剂，10 min后终止反应。在450 nm下检测吸光度，根据试剂盒标准曲线计算单位质量组织中IL- 1β和TN α的水平(pg·mg-1)。
1.3.5 肠黏膜通透性的测量 通过尿L和M比值评估肠黏膜通透性。将300 ml的L和 200 mg的M溶解在20 ml的蒸馏水中,在 12 h的禁食期后灌胃，剂量为1 ml。喂食后1 h，在乙醚麻醉下从海绵窦中取血，使用蜜二糖作为内标通过高效液相色谱测定L和M的浓度,检测L和M的浓度,计算L/M。
根据连通沟地形测量资料及实测断面资料，依据能量方程，按照50 m间距分段依次布设连通沟控制断面，再假定连通沟的过流量及东库水位，采用推求水面线的方法，推求西库水位，建立一组以东库水位为参数的连通沟流量~西库水位关系曲线，分析出连通沟的过水能力。
1.3.6 R qPCR 使用TRIzol试剂从结肠组织中提取总RNA，并使用Nanodrop 2000进行定量。使用RNeasy Mini试剂盒进行mRNA逆转录，使用 SYBR Premix Ex TaqTM进行R qPCR反应：95 ℃下持续2 min,58 ℃下维持20 s，然后在72 ℃下反应20 s(该步骤40个循环)，以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt法计算结肠黏膜中I 6和STAT3 mRNA的相对表达水平。
1.3.7 Western blotting 裂解结肠组织,通过离心(4℃，12 000 r·min-1，5 min)收集总蛋白。通过10%的SD PAGE分离40 μg的蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。加入5%脱脂牛奶(室温，2 h)封闭后加入 Z 1、 Occludin、 IL- 6、 STAT3(1∶800稀释，4 ℃，8 h)，洗涤后加入二抗(1∶2 000稀释，室温，1 h)。条带利用ECL可视化处理，GAPDH作为内参，分析紧密连接蛋白(Z 1和Occludin)、IL- 6和STAT3蛋白的相对表达量。
1.4 统计学处理
每个指标进行3次平行实验，统计分析使用SPSS 19.0统计软件。数据以平均值±标准差表示，进行方差分析，两两比较行SN q。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 金荞麦对UC小鼠疾病活动指数和结肠长度的影响
UC组疾病活动指数显著高于对照组，结肠长度显著短于对照组(P<0.05)。UC 金荞麦片组疾病活动指数显著低于UC组，结肠长度显著长于UC组(P<0.05)。见图1、表1。
表1 金荞麦对UC小鼠疾病活动指数和结肠长度的影响
组 别n疾病活动指数/分结肠长度/cm对照组150.00±0.008.56±0.91UC组1510.86±1.15a6.21±0.86aUC 金荞麦片组154.02±0.52ab7.58±0.93abF值20.9907.269P值<0.001<0.001
a 与对照组比较，P<0.05;b 与UC组比较，P<0.05
图1 金荞麦对UC小鼠疾结肠长度的影响
2.2 金荞麦对UC小鼠结肠黏膜损伤的影响
对照组小鼠结肠黏膜屏障完整；UC组小鼠结肠黏膜上皮细胞表现出明显的水肿，结肠黏膜完整性受损，出现炎性损伤。与UC组比较，UC 金荞麦片组小鼠结肠黏膜上皮细胞水肿显著减轻，结肠黏膜屏障完整性得到修复。见图2。
2）本文研究的结果从表2中的肘关节屈曲活动度的平均值走势可以看出，手拿工具的肘关节功能性活动度（用牙刷刷牙）比不拿工具的活动度（用手拿饼干吃）要小。从而康复医学工作者在评估后认为患者肘关节功能性活动度无法再改善时，应提醒患者使用工具或帮助制作特制的工具来改善肘关节功能。
图2 HE染色检测金荞麦对UC小鼠结肠黏膜损伤的影响
2.3 金荞麦对UC小鼠结肠炎症因子水平的影响
UC组结肠组织I 1β、TNF- α水平显著高于对照组(P<0.05)，UC 金荞麦组I 1β、TNF- α水平显著低于UC组(P<0.05)，见表2。
表2 金荞麦对UC小鼠结肠炎症因子水平的影响
组 别nIL-1β水平/(pg·mg-1)TNF-α水平/(pg·mg-1)对照组158.25±0.8611.23±1.18UC组1533.01±3.47 a38.76±4.52 aUC 金荞麦片组1516.98±2.52 ab22.59±3.24 abF值26.82422.824P值<0.001<0.001
a 与对照组比较，P<0.05;b 与UC组比较，P<0.05
2.4 金荞麦对UC小鼠肠黏膜通透性的影响
UC组肠黏膜L/M为3.25±0.38，显著高于对照组的0.64±0.07(P<0.05)；而UC 金荞麦片组肠黏膜L/M为1.79±0.24，显著低于UC组的3.25±0.38(P<0.05)。
2.5 金荞麦对UC小鼠肠黏膜屏障的影响
UC组肠黏膜组织紧密连接蛋白Z 1和Occludin的水平显著低于对照组(P<0.05)，UC 金荞麦片组的Z 1和Occludin蛋白水平显著高于UC组(P<0.05)，见图3和表3。
表3 金荞麦对UC小鼠肠黏膜紧密连接蛋白Z 1和Occludin表达水平的影响
组 别nZO-1Occludin对照组151.00±0.091.00±0.08UC组150.21±0.30 a0.24±0.30 aUC 金荞麦片组150.49±0.05 ab0.56±0.06 abF值19.18521.242P值<0.001<0.001
a 与对照组比较，P<0.05;b 与UC组比较，P<0.05
图3 Western blotting检测金荞麦对UC小鼠结肠黏膜中紧密连接蛋白Z 1和Occludin表达水平的影响
2.6 金荞麦对UC小鼠结肠组织I 6和STAT3 mRNA表达水平的影响
UC组结肠组织IL- 6和STAT3 mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)，UC 金荞麦片组结肠组织IL- 6和STAT3 mRNA水平显著低于UC组(P<0.05),见表4。
表4 荞麦对UC小鼠结肠组织中I 6和STAT3 mRNA表达水平的影响
组 别nIL-6 mRNASTAT3 mRNA对照组151.00±0.081.00±0.07UC组155.47±0.52 a5.62±0.51 aUC 金荞麦片组152.56±0.21 ab2.77±0.23 abF值32.90634.759P值<0.001<0.001
a 与对照组相比，P<0.05;b 与UC组相比，P<0.05
2.7 金荞麦对UC小鼠结肠组织I 6和STAT3 蛋白表达水平的影响
UC组结肠组织IL- 6和STAT3蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)，UC 金荞麦片组结肠组织IL- 6和STAT3蛋白水平显著低于UC组(P<0.05)，见图4和表5。
表5 金荞麦对UC小鼠结肠组织I 6和STAT3 蛋白表达水平的影响
组 别nIL-6蛋白STAT3蛋白对照组151.00±0.091.00±0.11UC组154.52±0.41 a4.57±0.42 aUC 金荞麦片组151.86±0.15 ab1.98±0.18 aF值32.47831.846P值<0.001<0.001
a 与对照组比较，P<0.05;b 与UC组比较，P<0.05
图4 Western blotting检测金荞麦对UC小鼠结肠组织I 6和STAT3 蛋白表达水平的影响
3 讨 论
目前UC的病因和发病机制仍不确定，遗传易感性、黏膜免疫系统失调、肠道微生物群失调和饮食习惯等因素是UC发展的重要因素[10]。目前UC的治疗主要采取服用氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫抑制剂和生物制剂，重度难治UC需要手术治疗[11]。由于药物无效、药物依赖、不良反应，仍有一部分患者长期遭受UC困扰[12]。因此，为UC寻找新的治疗方法和药物极为重要。
金荞麦分布于东亚和南亚，已被列为国家二级保护植物，并且被我国国家卫生和计划生育委员会批准为功能性食品[13]。在中医机理中，金荞麦性凉，味辛、苦，块根供药用，具有清热解毒活血化瘀之功效[14]。金荞麦具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌的功能，被批准应用于急性肺脓肿以及急慢性气管炎[15]。金荞麦片与培菲康共同使用能够显著缓解慢性结肠炎患者的临床症状[16]。为分析金荞麦对UC的影响，本研究利用DSS诱导UC急性发作的小鼠模型，然后通过金荞麦片进行灌胃处理。结果表明，UC模型小鼠出现明显的大便性状改变和大便潜血，结肠长度缩短，结肠黏膜组织受损，结肠组织中促炎因子IL- 1β和TN α的水平显著升高；而金荞麦片灌胃可显著降低疾病活动性，缓解炎症反应，保护结肠组织。结合文献，本研究结果表明,金荞麦可显著地缓解UC症状，抑制炎症反应。
为进一步分析金荞麦缓解UC抑制炎症反应的机制，本研究检测了IL- 6/STAT3通路以及紧密连接蛋白Z 1和Occludin的表达水平。IL- 6在UC中显著升高，并且与疾病的严重程度呈正相关[17]。而IL- 6会促进转录因子STAT3的表达，促进IL- 1β和TN α等促炎因子的转录和表达[18]。STAT3可通过直接或者间接的作用导致结肠黏膜中紧密连接蛋白Z 1和Occludin表达降低，破坏肠黏膜屏障，提高通透性[19]。结肠黏膜屏障的破坏不但会导致粪便含水量升高，还会导致肠道组织中的病原体或者内毒素入侵体内，进一步加剧炎症反应[20]。临床研究[21]显示，金荞麦片可显著抑制哮喘患者IL- 6的表达。本研究结果显示，UC模型小鼠肠黏膜通透性显著升高，结肠黏膜组织中Z 1和Occludin蛋白的表达水平显著降低，并且IL- 6和STAT3转录和蛋白水平显著升高。而金荞麦片灌胃则可提高Z 1和Occludin蛋白的水平，抑制肠黏膜通透性，并在mRNA和蛋白的水平上抑制UC模型小鼠结肠黏膜组织中IL- 6/STAT3通路。结合文献，本研究结果表明，金荞麦片可能通过抑制IL- 6/STAT3通路的转录和蛋白的表达抑制炎症反应，并促进Z 1和Occludin蛋白的表达，保护肠黏膜屏障，从而缓解UC。
然而，本研究也有一定的局限性：本实验为定性研究，只表明金荞麦具有抗炎和缓解UC的作用，但是金荞麦治疗UC的药效关系和安全性仍需要进行大量的动物实验和临床研究。此外，关于金荞麦抑制I 6/STAT3通路的作用仍需要挽救实验证实，其调控的分子机制也需要深入研究。
综上所述，金荞麦可通过抑制I 6/STAT3通路抑制炎症反应，保护肠黏膜屏障，缓解UC。这提示服用金荞麦片可成为治疗UC的新方法。
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