【原】前沿研究|16s+宏基因组binning揭示大型藻类附生微生物群落核心组成

发表期刊：Microbiome

发表时间：2023

影响因子：15.5

DOI: 10.1186/s40168-023-01559-1

研究背景

大型藻类附生微生物群落是新型酶类和化合物的丰富资源，在维持沿海系统的高生物生产力和生物多样性方面发挥着重要的作用。但迄今为止的研究主要集中在基于微生物多样性分析或有限的单一大型藻类物种的宏基因组测序上。对于不同大型藻类中常见的核心细菌，在分类、代表性基因组和生态生理功能等方面的研究尚且缺乏。

研究方法

本研究区域位于中国威海沿海一个固定的礁石上，分别在四个季节（春、夏、秋、冬）对石莼（Ulva sp. 绿藻），海带（Saccharina sp. 褐藻），石花菜（Grateloupia sp. 红藻）和蜈蚣藻（Gelidium sp. 红藻）等4种藻类，以及海水和沉积物进行取样，随后通过16s rRNA多样性测序、单菌基因组扫描图测序以及深度宏基因组测序手段来研究藻圈细菌微生物的组成以及大型藻藻际微生物组的组成和分布。

图1 技术流程图

主要结果

1、所有藻类均具有相似而多样的藻圈群落特征，且具有显著的季节性

基于ASV的α多样性结果表明，藻际样本的多样性与海水样本的多样性相似，但是低于沉积物的样本多样性。主坐标分析（PCoA）结果显示，三种不同生境（藻际、海水、沉积物）的样本可以明显的分开（图2a），存在显著的差异。对藻际样本进行两两比较，结果没有发现显著差异，表明大型藻类物种之间存在相当程度的核心类群（图2b）。随后，当去除核心种群之后，样本根据季节聚类更加的明显，表明非核心类群对季节变化的贡献更大（图2c）。

图2 基于未加权的UniFrac距离的PCoA分析

2、藻际微生物群落主要以少量的核心类群为主

ASV分析显示藻际大部分的细菌科水平只包含一到两个属，少数细菌如Flavobacteriaceae和Rhodobacteraceae有更广泛的属水平代表。这种较低的整体均匀度强调了藻际群落主要由少数丰富的进化枝主导。来自8个科的14个核心属在所有的大型藻类中都存在，并且至少在一个样本中的丰度≧1%。

图3 系统发育计算结果图

表1 14个藻际核心属和优势属的物种列表

3、来自16个藻际丰富的核心属和优势属的230个物种

基于16S rRNA测序分析，本研究共培养了5,527株菌株（大型藻类4426株）。这些菌株包括735个新种（来自大型藻类的有577个），除去分类不完整29株菌株以外，共有230个物种（1556株菌株）代表6/14的藻际核心属和10/14的藻际优势属。

图4 依靠大型藻类宿主、培养基和季节的可培养藻际细菌

4、大规模数据的藻际细菌的基因组草图和MAG，包括新物种

基于16S rRNA序列相似性，本研究选择了965株（大型藻类：864）菌株初步测序，其中550余新种，42余新属。与14131个已发表的参考基因组进行比较，得到的基因组草图对应于652个物种（95% ANI，65% alignment），代表了820个非冗余DGs（基因组草图）（99% ANI）。

从宏基因组数据中获得了1619个完整度≧50%，污染度<10%的MAGs。为了确定物种总数，研究还使用基于多步距离的方法（95% ANI）对最初的965个DGs和1,619个MAGs进行了聚类（图5）。结果得出1781种原核生物，1689种细菌和49种古细菌，古细菌的总体丰度很低，厚壁菌门也是如此。大型藻际细菌的基因组大小平均大于沉积物和海水的细菌基因组（图5b）。

图5 宏基因组组装基因组（MAGs）和基因组草图（DGs）

5、藻际拟杆菌门含有很高未知比例的基因并主导了藻类多糖的降解

基于EggNOG、COG、Pfam数据库对DGs和MAGs进行功能注释，平均功能预测率分别为80.9%、75.9%和77.1%。而当基于UniProtKB和KEGG数据库进行注释时，分别有46.8%和75.6%的基因没有注释结果。其中，在所有门中，从培养的拟杆菌门（305个来自大型藻类）获得的376个基因组中未知基因的比例最高。这说明大型藻类定殖Bacteroidota具有特别丰富的未知功能的基因资源。

研究搜索了所有DGs和MAGs的活性酶（CAZyme）基因，鉴定了292,848个同源基因。在拟杆菌门中发现了大多数CAZyme基因（61.8%），证实了该门成员在藻类多糖降解中发挥的关键作用。该研究进一步预测了4451个多糖利用位点（PULs），6376个PUL-like基因簇，19826个CGCs和1699个susCD基因对，大多数发现于DGs中。与海水相比，藻际的PUL数高1.6倍，沉积物基因组的PUL数高2.8倍。在藻际中，富含PUL的物种主要属于Zobellia、Polaribacter、Aquimarina、Tenacibaculum、Algitalea和Maribacter，代表了藻际的核心属或优势属。

图6 PUL在宏基因组组装基因组（MAGs）和基因组草图（DGs）中的分布

6、藻际类群，尤其是拟杆菌门具有丰富的生物合成基因簇

该研究鉴定到了8810个假定的生物合成基因簇（BGCs），由于DGs通常比MAGs更完整，因此它们具有较低比例的不完整BGCs。BGCs数量最多的前100个基因组中有93个属于藻际细菌，BGCs数量最多的前20个基因组中有10个属于藻际拟杆菌门（图7b）。拟杆菌门具有高比例的用于萜烯和NRPS生物合成的BGC，例如新的核心藻际物种Aquimarina sp. 2-328。

图7 生物合成基因簇在1619个宏基因组组装基因组（MAGs）和965个基因组草图（DGs）中的组成和分布

大多数BGC在拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门等中被鉴定，所有类群都富含核心藻际细菌。核心/优势藻际类群成员包含具有非常高的BGC比例。大多数预测的BGC产物都是未分类的，这反映了藻际细菌具有尚未探索的生物合成功能的丰富资源。

图8 生物合成基因簇分析

结论

综上所述，本研究结果不仅证实了所有取样的大型藻类都具有相似的藻际群落特征，而且还获得了689个新物种的分离菌株。特别是成功地培养了大量的核心和优势藻际类群你，用于未来深入的功能研究。同时，本研究提供的基因组数据有望为未来整个大型藻类微生物群的宏转录组研究提供有价值的搜索空间。

参考文献

Epiphytic common core bacteria in the microbiomes of co-located green (Ulva),brown(Saccharina) and red (Grateloupia, Gelidium) macroalgae. Microbiome, 2023.