【原】2023年诺贝尔生理学或医学奖授予新冠mRNA疫苗的原创研究：减少炎症反应并提高蛋白质翻译效率的mRNA修饰

GCTA 2023-10-02 发布于云南

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Discoveries concerning nucleoside base modifications that enabled the development of effective mRNA vaccines against COVID-19

▲原文标题&参考译文▼

发现一种有助于开发有效的新冠mRNA疫苗的核苷碱基修饰

【时间】 2023年10月2日在线发表

【来源】 诺贝尔奖官网（https://www./）

【获奖者】 卡塔琳·卡里科（Katalin Karikó）、德鲁·魏斯曼（Drew Weissman）
【主办方】瑞典卡罗琳斯卡医学院
【奖金金额】1100万瑞典克朗（人民币7258950元）
【资金来源】阿尔弗雷德·诺贝尔基金会

【核心内容】

2023年10月2日， 诺贝尔奖官网公布2023年诺贝尔生理学或医学奖，德国生物技术公司BioNTech的卡塔琳·卡里科（Katalin Karikó）和美国宾夕法尼亚大学教授德鲁·魏斯曼（Drew Weissman）获此殊荣。获奖理由是他们在核苷碱基修饰方面的发现使得人们能针对 COVID-19 开发有效的 mRNA 疫苗。

https://www./prizes/medicine/2023/summary

两位科学家的突破研究使得高效率的新冠mRNA疫苗得以被快速研发，也已凭此获得了多项大奖，包括2022年美国科学突破奖（Breakthrough Prize）、2021年拉斯克基础医学研究奖（The Lasker Awards）、2023年盖尔德纳奖等。

2019年末，当SARS-CoV-2开始爆发并迅速传播到世界各地时，很少有人能预料到疫苗能够如此快速地开发出来并帮助遏制全球疫情。但两种最快获得批准且最有效的疫苗就是采用了最新的mRNA技术。

早在30多年前，就有科学家提出了利用mRNA进行疫苗接种和治疗的概念，但是要使其成为临床现实需要克服多个障碍。早期的实验表明，体外转录的mRNA会引发不良的炎症反应，并导致细胞和组织中蛋白质的产生效率低下。

然而，Karikó和Weissman的发现是一个重要的转折点。他们证明，通过修饰碱基的mRNA可以逃避先天免疫系统的识别，并提高蛋白质的表达效率。这一发现与体内mRNA传递系统的开发、SARS-CoV-2刺突抗原的稳定以及行业和政府的大量投资相结合，使得两种基于mRNA的COVID-19疫苗在2020年末获得批准。

天然mRNA（左）和修饰mRNA（右）

Karikó和Weissman的发现对使mRNA疫苗平台能够在最需要的时候应用于临床起到了关键作用，对医学做出了非凡的贡献，并为未来的mRNA应用铺平了道路。

在当今全球互联的社会中，新型大流行病的风险比以往任何时候都更大。大流行病通常由穿越物种屏障进入人类，并通过飞沫或气溶胶传播引起呼吸道感染的人畜共患病毒引起。在足够快速地开发和推广疫苗以减轻持续大流行病的压力下是一个巨大的挑战，在COVID-19大流行之前从未有人能够满足这一挑战，当然也还没有一种基于mRNA的疫苗获得人类使用批准。

然而，结合了过去几十年在分子生物学、疫苗研究和药物传递方面的广泛发展，2020年SARS-CoV-2基因组序列的快速分享引发了前所未有的疫苗研究活动。学术界和工业界的科学家们在创纪录的时间内启动了疫苗研发项目，并得到了政府、工业界和非营利组织的财务和后勤支持。新型mRNA疫苗平台被视为最有希望的选择之一。

新冠肺炎大流行前的疫苗生产方法

目前大多数已获许可的抗病毒疫苗都是使用基于弱化或灭活全病毒、重组病毒蛋白成分或携带感兴趣抗原的病毒载体制成的。分子生物学和重组蛋白生产技术的发展，使得出现了更有针对性的亚单位疫苗和载体疫苗。但传统的全病毒疫苗和病毒载体疫苗需要基于细胞培养的制造设施。因此，疫苗研究人员长期以来一直对开发亚单位疫苗很感兴趣，这种疫苗通过将核酸直接传递给疫苗接受者，利用机体自身产生蛋白质的能力，可以促进更快速、更低成本的疫苗生产。

目前使用的疫苗由弱化或灭活的全病毒、重组病毒蛋白成分（亚单位疫苗）或递送感兴趣抗原的病毒载体（载体疫苗）制成。疫苗接种事件刺激抗原特异性免疫反应，如果接种疫苗的人后来暴露于活病原体，则可以为人体快速产生抗体并提供保护。

基于核酸和病毒载体的疫苗的早期工作

基于核酸的免疫可以起作用的第一个证据可以追溯到20世纪90年代早期，当时 DNA 疫苗和 mRNA 疫苗首次在小鼠中进行了测试。这些方法有几个潜在的优势。以核酸为基础的疫苗不仅易于制造，而且由于序列易于改变以编码不同的抗原，因此也具有灵活性。加上易于生产，这使得新的候选疫苗的迭代测试和更新疫苗的生成迅速而有效。一个生物学优势是，除了抗体和主要组织相容性复合体(MHC) II 类限制性 CD4 + T 细胞应答(也由其他疫苗类型诱导)外，基于病毒载体和核酸的疫苗有可能刺激细胞毒性 CD8 + T 细胞应答，因为它们允许在 MHC I 类分子上呈递内源性产生的抗原肽。CD8 + T 细胞的诱导在以杀死靶向肿瘤细胞为目标的癌症疫苗中特别有意义，同时对于消除感染细胞的抗病毒疫苗也是如此。然而，尽管基于核酸的疫苗具有潜在的优势，但是它们是否具有良好的耐受性并刺激人类足够强大的免疫应答以代表临床疫苗开发的可行途径尚不清楚。

最初，DNA 疫苗被认为比 mRNA 疫苗更有前途，因为 DNA 更稳定。然而，小动物 DNA 疫苗的研究进展缓慢，早期令人鼓舞的结果并没有转化为人类。一个可能的原因是，被注射的 DNA 必须跨越质膜和核膜这两个屏障，才能到达转录发生的细胞区室(DNA 转化为 mRNA)。相比之下，基于 mRNA 的疫苗只需要进入发生转化的细胞质(mRNA 转化为蛋白质) ，使传递更容易。MRNA 疫苗的另一个优点是，递送的核酸不能整合到宿主基因组中，这为该平台增加了一个重要的安全性方面。尽管有这些优点，但是由于 mRNA 被认为对于医学应用来说太不稳定，因此对这种方法的有用性的怀疑仍然很高。

在这种背景下，疫苗领域转向使用工程病毒载体，因为它们有自己的内在机制进入细胞和提供遗传货物。自20世纪90年代以来，针对各种病原体的许多不同类型的基于病毒载体的疫苗已经在临床前进行了测试，证明了有希望的结果和挫折。基于病毒载体的疫苗的一个缺点是，除了针对感兴趣的抗原引发的所需应答之外，可以诱导针对用于包装载体的结构蛋白的抗体，如果再次使用相同的载体，则损害加强应答。尽管如此，在2019冠状病毒疾病大流行期间，使用不同类型的工程化腺病毒开发了有效的基于病毒载体的疫苗，并进行了大规模使用，证明了它们的有用性，特别是在大流行的早期阶段。

在20世纪90年代，一小群研究者继续探索 mRNA 作为潜在疫苗平台的应用。早期的研究表明，从细胞中纯化的 mRNA 在重新导入卵母细胞时转化为蛋白质。接下来的挑战是将活的有机体输送到组织中。1990年，Philip Felgner 及其同事发表了第一项研究，证明将裸露的 mRNA 注射到骨骼肌中可以在体内产生蛋白质。不久之后，Martinon 等人在注射了编码流感病毒核蛋白的脂质体 mRNA 的小鼠中证明了抗原特异性细胞毒性T细胞反应的诱导作用。

同时，一些研究者开发了病毒复制子疫苗，其具有在每个细胞中产生更高拷贝数的抗原编码转录物的额外优势，导致在体内递送裸 mRNA 后诱导强大的抗原特异性免疫应答。这些早期的研究刺激了这个领域，并导致在动物模型中展示了有希望的结果，但是这需要超过20年的时间，直到第一个基于 mRNA 的感染疫苗在人类临床试验中进行测试。

mRNA和体外转录系统的发现促进了基于mRNA的应用的探索。通过几十年的研究，科学家们发现了合成mRNA的高效系统，并且成功地将这些mRNA传递到细胞和组织中。此外，人们还探索了使用mRNA传递治疗性蛋白的潜力，为治疗人类疾病提供了新的思路和可能性。卓越的科研成果引起了广泛关注，并有望在临床上实现应用。

mRNA向树突状细胞的传递及天然感应的作用

20世纪90年代末，Karikó和Weissman合作，通过将体外转录的mRNA传递给树突状细胞并利用其天然感知作用，探索了基于mRNA的疫苗研究。他们发现，树突状细胞摄取编码HIV-1结构蛋白Gag的mRNA后可以刺激CD4+和CD8+ T细胞反应，并导致树突状细胞的激活和成熟。此外，他们还发现mRNA中的双链RNA污染物可以通过激活TLR3引发细胞因子反应。这些发现为开发基于mRNA的疫苗打下了重要基础。

树突状细胞是桥梁，连接着先天免疫系统和适应性免疫系统。它们通过表面和内质网Toll样受体（TLRs）识别不同的核酸结构，产生抗病毒细胞因子。研究显示，TLR3能够感知双链RNA，TLR7和TLR8能够感知单链病毒RNA和某些合成RNA。Karikó和Weissman发现体外转录的mRNA中含有污染的双链RNA，可以通过激活TLR3引发细胞因子反应。此外，核苷酸的组成也对反应起到了一定影响。

简言之，Karikó和Weissman的研究表明mRNA可以被传递给树突状细胞，并利用其天然感知能力来刺激免疫反应。同时，他们的研究还揭示了TLR3和核苷酸组成在mRNA免疫活性中的重要作用。这些成果为基于mRNA的疫苗开发提供了理论基础。

将体外转录的各种修饰方式（包括没有修饰）的mRNA转染到原代树突状细胞中后评估其有效性和安全性。（a） T7体外转录系统用于产生具有典型RNA碱基（a、U、G和C）或修饰碱基的mRNA。（b）显示了用于RNA-1571体外转录的碱基，其中未导致TNF-a分泌的碱基用橙色表示（由Karikó等人Immunity 2005修改）。

Karikó和Weissman的突破性发现

Karikó和Weissman在不同类型的RNA上进行了仔细的研究，其成果于2005年发表。该研究描述了mRNA碱基修饰对树突状细胞细胞因子反应的影响。他们发现真核生物mRNA和tRNA中丰富的碱基修饰不会刺激细胞因子反应，而原核生物和体外转录的mRNA则会。他们进一步证明了将伪尿嘧啶(Y)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基尿嘧啶(m5U)或2-硫尿嘧啶(s2U)纳入体外转录的mRNA中时，可消除这些mRNA对树突状细胞的炎症反应的激活。重要的是，只有尿嘧啶的修饰(m5U、s2U和Y)才能抑制DC的活化。

研究人员迄今已揭示出超过一百种不同的转录后修饰，并显示修饰在真核生物的RNA中比原核生物更为广泛。伪尿嘧啶(Ψ)早在1951年就被发现，是最常见的RNA修饰之一，最初发现在tRNA和小核RNA(snRNA)中，最近在其他类型的RNA中也有发现。细胞通过酶反应或使用小核核糖核蛋白(snoRNPs)复合物对RNA进行修饰。RNA修饰对RNA稳定性、碱基配对特异性、折叠和其他功能特性起着作用。尽管已知超过一百种RNA修饰，但大多数修饰的功能数据仍然有限。因此，理解这些修饰的生理意义仍然是一个活跃的研究领域。

Karikó和Weissman的发现解释了40多年前Isaacs和同事的一个观察结果，即将脱氨基RNA传递到细胞中会导致比对照RNA更强的1型干扰素反应。脱氨基增加了RNA中尿嘧啶的比例，Karikó和Weissman已经证明这对树突状细胞的活化非常重要。后续的研究显示，单独使用N1-甲基伪尿嘧啶(m1ψ)，或与m5C结合使用，进一步改善了mRNA平台，减少了对先天免疫受体的识别，并增加了蛋白质表达。其中一部分可以通过增加m1ψ含量的mRNA上的核糖体占用来解释。如今，m1ψ是用于mRNA疫苗生产中最常见的修饰碱基，包括在2020年末批准的两种COVID-19疫苗中。

在Karikó和Weissman的突破性发现之后，他们还证明了含有伪尿嘧啶的mRNA在细胞内更高效地被翻译，从而导致更高的蛋白质产量。在同一研究中，他们还展示了将修饰的mRNA传递到小鼠脾脏中会导致增加的蛋白质产量和降低的免疫活化，这对于未来的治疗应用至关重要。Karikó、Weissman和同事进一步证明，体外转录的mRNA可以激活蛋白激酶R(PKR)，一种通过磷酸化真核翻译起始因子2α(eIF2a)识别双链RNA并阻断蛋白质翻译以保护细胞免受侵入病原体的抗病毒蛋白。团队表明，使用修饰的碱基减少了PKR的激活并提高了蛋白质产量。识别体外转录的mRNA的2’5’寡腺苷酸合成酶(OAS)和通过OAS诱导的RNase L酶降解的程度在含有修饰碱基的RNA中也减少了。

此外，Karikó和同事还展示了通过HPLC纯化步骤或与BioNTech的Uğur Şahin等人合作使用基于纤维素的纯化步骤可以去除体外转录过程中产生的双链RNA污染物，从而进一步提高体外转录的mRNA的蛋白质表达。

碱基修饰的体外转录mRNA蛋白质表达量更高。用假尿苷（ψ）取代尿苷（U），产生碱基修饰的体外转录mRNA。当将碱基修饰的mRNA引入细胞时，与未修饰的mRNA相比，观察到蛋白质产量增加。

新冠mRNA疫苗的研制

mRNA疫苗发展历经了60年光阴（如下图）。2010年，三家主要公司成立了mRNA技术项目：CureVac于2000年成立，旨在开发针对感染和癌症的疫苗；BioNTech于2008年成立，旨在开发个性化癌症疫苗；Moderna于2010年成立，计划利用mRNA平台将体细胞重编程为多能细胞，并传递治疗性蛋白质，例如修复受损组织。这三家公司与学术研究人员紧密合作，改进技术并评估各自在感兴趣领域中的平台。

mRNA疫苗发展历程。图源：Nik Spencer/Nature；知识分子改编自U. Şahin et al. Nature Rev. Drug Discov. 13, 759–780 (2014)和X. Hou et al. Nature Rev. Mater. https:///gmjsn5 (2021).

Curevac团队包括Ingmar Hoerr、Günter Jung、Steve Pascolo和Hans-Georg Rammensee，他们早早意识到mRNA技术的潜力。他们通过优化mRNA 5'和3'非翻译区和密码子优化的方法改进蛋白质产生效率，而无需使用修饰碱基。2000年，他们报告称给小鼠注射RNA（裸露或与脂质体结合）会引发抗原特异性适应性免疫反应（抗体和CD8+ T细胞反应），其中脂质体封装的RNA产生更高的免疫反应。大约8年后，他们评估了首个mRNA疫苗，提取了黑色素瘤患者的肿瘤遗传物质，用于生成mRNA，并使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为佐剂进行自体疫苗注射。该方法被证明安全，并且在一些患者中增强了抗肿瘤免疫反应。2012年，Curevac团队报告称在几种动物模型中诱导免疫应答以保护性应对流感病毒感染，2017年，在临床试验中测试了首个针对传染病（狂犬病）的mRNA疫苗。

mRNA 接种后棘突的产生及 B 细胞对棘突的识别。在脂质纳米颗粒的促进下，mRNA 进入细胞后，作为棘突蛋白产生的模板。然后棘突在细胞表面短暂表达，在那里它被 B 细胞通过它们的 B 细胞受体(BCR)识别，刺激棘突特异性抗体的分泌。

在Zika疫苗试验期间，Moderna还与NIH疫苗研究中心的Barney Graham和他的团队合作开发了针对中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）的mRNA疫苗。该疫苗编码了MERS spike的预融合稳定形式，在S2区域引入脯氨酸等修饰以防止亚稳态的预融合形式转变为后融合形式。早期的研究表明，在低pH下，向流感病毒血凝素2区域（HA2）中引入脯氨酸（发生环到螺旋的转变）会干扰流感病毒与宿主细胞融合的能力。基于这一发现以及来自不同病毒家族的病毒已经进化出类似的融合目标细胞的解决方案的知识，适当位置的脯氨酸已被置换到多种病毒的刺突糖蛋白中，使其稳定在各自的预融合形式中，其中包括HIV-1、RSV和SARS-CoV-2。Jason McLellan团队于2020年初发布的SARS-CoV-2 spike的高分辨率结构对定义中和抗体表位和后来出现的SARS-CoV-2变异体的抗体逃逸突变至关重要，这些信息对我们理解疫苗诱导的免疫保护非常重要。Pfizer/BioNTech和Moderna开发的mRNA疫苗以及Janssen的载体疫苗和Novavax开发的蛋白质疫苗中均使用了SARS-CoV-2 spike的预融合稳定形式。

总之，2020年底，两种有效、安全的2019冠状病毒疾病 mRNA 疫苗获得批准，推动 mRNA 疫苗领域进入了一个新时代。在体外转录的 mRNA 中使用修饰的碱基避免了炎症反应这一副作用，并且在体内递送后增加了蛋白质的产生，这一发现证明了基础研究的价值。Karikó 和 Weissman 在2005年发表的开创性论文中公布的研究结果在当时没有引起多少关注，但在2019冠状病毒疾病大流行期间发挥了重要作用，所以他们值得授予今年的诺贝尔奖。

根据知识分子公众号报道，迄今为止，共有225名科学家获得过诺贝尔生理学或医学奖（截至2022年颁完奖），刚刚得奖的卡塔琳·卡里科是第13位获得该奖的女性科学家。

在卡塔琳·卡里科之前，得过该奖的女性科学家包括格蒂·科里（1947年）、罗莎琳·萨斯曼·耶洛（1977年）、巴巴拉·麦克林托克（1983年）、丽塔·列维-蒙塔尔奇尼（1986年）、格特鲁德·B·埃利恩（1988年）、克里斯汀·纽斯林-沃尔哈德（1995年）、琳达·巴克（2004年）、弗朗索瓦丝·巴尔-西诺西（2008年）、伊丽莎白·布莱克本（2009年）、卡罗尔·格雷德（2009年）、迈-布里特·莫泽（2014年）和屠呦呦（2015年）。

参考文献（上下滑动阅读）
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