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大家好，今天和大家分享的是华南理工大学生物医学科学与工程学院的边黎明教授在期刊Nature Commu nications上发表了一篇题为 “Enhan ced mechano sensing of cells in synthetic 3D matrix with controlled biophy sical dynamics” 的工作，作者通过探究动态交联的结合动力学如何影响水凝胶网络动态变化的时间尺度和细胞黏附配体的偶联稳定性，发现将短寿命的动态交联与稳定的细胞黏附配体结合之后，在含β1类整合素的细胞粘附结构、新生胞外基质蛋白和细胞内肌球蛋白收缩性协同作用的影响下，三维水凝胶中干细胞会发生快速的星状铺展、力学感知和成骨分化。 01 研究背景 在设计生物材料基质中对细胞进行3D培养可提供仿生细胞微环境，并且可以对传统2D培养无法提供的细胞行为产生关键见解。通过结合可降解的结构组分或可逆的动态交联来实现具有动态特性的水凝胶能够有效地适应基质的细胞并支持相关的细胞功能。 在此，我们证明，给定相似的平衡结合常数，含有具有大解离速率常数的动态交联的水凝胶能够使细胞力诱导的网络重组，这导致快速星状扩散，组装，机械传感和分化封装的干细胞与含有具有低解离速率常数的动态交联的类似水凝胶相比。 见图一 由具有不同结合动力学的可逆主客体交联稳定的超分子水凝胶具有差异动力学特性。  a 通过不同对的宿主-客体络合物（环糊精-金刚烷/环糊精-胆酸或CD-ADA/CD-CA）稳定的超分子透明质酸水凝胶的制备示意图，以及包封hMSCs的3D扩散监测。 b 在培养基中孵育3天后测量的水凝胶溶胀率。数据以平均值表示±SD（标准偏差），每组n = 3个独立水凝胶，N.S.表示无统计学差异。（双尾学生 t 检验）。 c 流变学分析中 G′ 和 G“ 的平均值，频率为 0.1 Hz 和 1% 应变。数据以平均值表示±标准偏差，每组n = 3个独立水凝胶，N.S.表示无统计学差异（方差分析），**p < 0.01，***p < 0.001（双尾学生t检验）（A80C20，A50C50，A20C80分别通过混合HA-ADA和HA-CA以80%：20%，50%：50%或20%：80%的重量比制备）。 见图二 hMSCs在3D水凝胶内表现出差异扩散，该水凝胶由具有不同寿命的动态交联稳定。  图二 a 在培养第 1、3 和 7 天封装在不同组（HA-ADA-cRGD 和 HA-CA-cRGD）的水凝胶中的 hMSC 的代表性图像，对肌动蛋白（红色）和细胞核（蓝色）进行了染色。比例尺 =100 μm. b 从共聚焦图像对 hMSC 进行 3D 重建。比例尺 =100 μm. c 封装在不同组（HA-ADA-cRGD 和 HA-CA-cRGD）的水凝胶内的 hMSC 的圆度（平均细胞圆度指数根据 C = 4πA/P 计算2，其中 A 是像元面积，P 是像元周长）。数据以SD±平均值表示，n = 12个独立水凝胶的每组2个细胞;N.S. 表示没有统计学差异，**p < 0.01，***p < 0.001（方差分析或双尾学生 t 检验）。 d 在用不同寿命交联制备的水凝胶中进行成骨培养 1 天后，对 hMSC 中长春culin和 β 3 整合蛋白表达进行蛋白质印迹分析。样品来自同一实验，凝胶/印迹平行处理。（相对强度详情见补充表2） e 在培养 3 天（比例尺 = 50 μm）和核 YAP 荧光强度（细胞核和细胞质之间的强度比）后，在封装在 HA-ADA-cRGD 和 HA-CA-cRGD 水凝胶中的 hMSC 中针对 F-肌动蛋白（红色）、细胞核（蓝色）和 YAP（绿色）的代表性免疫荧光染色数据以平均值表示± SD，n = 来自两个独立水凝胶的每组 12 个细胞;p < 0.001（双尾学生 t 检验）。 f 培养3天后，用不同重量比的HA-ADA和HA-CA客体聚合物制备的水凝胶中包封的hMSCs中针对F-肌动蛋白（红色）、细胞核（蓝色）和YAP的代表性免疫荧光染色（A80C20、A50C50、A20C80通过混合HA-ADA-cRGD和HA-CA-cRGD以80%：20%的重量比制备。分别为50%：50%或20%：80%）以及细胞圆度和核YAP荧光强度（细胞核和细胞质之间的强度比）的定量。数据以平均值表示±SD，n = 12个细胞，来自两个独立水凝胶，***p < 0.001（双尾学生t检验），比例尺= 25μm。 见图三 MD和KMC模拟结果验证了主客体交联结合动力学在实现细胞介导的水凝胶网络重组中的关键作用。  图三 a MD模拟快照显示了当HA-ADA或HA-CA水凝胶中的主客体交联分别处于结合和未结合状态时，HA段的一端（红点）施加力。两种齐聚丙烯酰β-环糊精交联剂（每种含有三张CD）分别以橙色和黄色显示。 b 对于给定的施加力大小，使用束缚状态的 CD-ADA 对进行了 5 次 240 ns 仿真。在总共 102 次模拟中，仅在 F = 0 pN 的两个模拟中观察到解绑定事件。* 表示值为 60。对于处于结合状态的CD-CA对，在F = 102 pN下进行的480次模拟未发现未结合事件。 c 在另一组 5 次 1 ns 模拟中，给定的 CD-ADA 或 CD-CA 对最初处于未结合状态，我们测量了施加力的方向与相应 HA 链的运动之间的相关系数（值范围从 -1 到 60）。误差线表示平均值的标准误差。n = 3。 d 在c所示的同一组模拟中，HA链运动的“速度”由最接近被拉动的HA端的客体分子的扩散系数表征。将给定力下进行的0次模拟结合起来，以估计线性回归模型的扩散系数，其误差小于线宽（补充表01）。 e 丝状伪足中平行肌动蛋白束及其面对的交联HA网络的示意图。f 在F = 10 pN下肌动蛋白聚合的估计时间尺度（~100.000 s）内发生开门事件的概率，基于2,<> KMC计算的集合，假设n = <>在丙烯酸化宿主复合物中（详见补充信息）。 见图四 细胞粘附配体与通过交联连接的水凝胶子网的精确共价偶联是 hMSC 的高效 3D 扩散和机械传感所必需的。  图四 a A50C50水凝胶的制备示意图，在水凝胶中具有选择性RGD偶联和3D细胞培养。RGD肽仅与A50C50水凝胶中的HA-ADA子网（A50-cRGD：C50）或HA-CA子网（A50：C50-cRGD）偶联。 b 在 50 天培养（比例尺 = 50 μm）和圆度和核 YAP 荧光强度（细胞核和细胞质之间的强度比）后，用选择性 RGD 偶联封装在 A3C25 水凝胶中的 hMSC 中针对 F-肌动蛋白（红色）、细胞核（蓝色）和 YAP（绿色）的代表性免疫荧光染色。数据以SD±平均值表示，n = 来自两个独立水凝胶的每组12个细胞;p < 0.001（双尾学生 t 检验）。 c 使用不同的RGD偶联方法（HA-ADA-cRGD和HA-ADA-pRGD）制备水凝胶和具有不同RGD偶联方法的3D细胞培养的示意图。 d 培养3天和1天后，用不同的RGD偶联方法（HA-ADA-cRGD和HA-ADA-pRGD）封装在水凝胶（3D细胞封装）中的hMSCs的代表性图像。比例尺 = 200 μm。 e 在高动态 HA–ADA–cRGD 水凝胶中培养的 hMSC 中针对 F-肌动蛋白（红色）、细胞核（蓝色）和 pFAK 或长春斑蛋白（绿色）的代表性免疫荧光染色 3 天。比例尺 = 50 μm。 f 用不同的 RGD 偶联方法（HA-ADA-cRGD、HA-ADA-pRGD 和 HA-ADA）封装在水凝胶中的 hMSC 中的核 YAP 荧光强度（细胞核和细胞质之间的强度比）定量培养 3 天后。数据以平均值表示±SD，n = 来自两个独立水凝胶的每组10个细胞;p < 0.001（双尾学生 t 检验）。 见图五 交联寿命短的超分子水凝胶促进包封hMSC的成骨分化。  图五 a 在成骨培养 2 天后，通过 RT-PCR 定量包封在水凝胶（HA-ADA-cRGD 和 HA-CA-cRGD）中的 hMSC 的 Runx 7、ALP、I 型胶原蛋白和 OCN 基因表达。值被标准化为HA-ADA-cRGD内的表达水平。数据以平均值表示±SD，n = 3个独立水凝胶;**p < 0.01（双尾学生 t 检验）。 b 在成骨培养 2 天后，通过 RT-PCR 定量封装在水凝胶（HA-ADA-cRGD、HA-ADA-PRGD 和 HA-ADA）中的 HMSC 的 Runx 7、ALP、I 型胶原蛋白和 OCN 基因表达。值被标准化为HA-ADA-cRGD内的表达水平;数据以平均值表示±SD，n = 3 independent水凝胶;**p < 0.01，***p < 0.001（双尾学生 t 检验）。 c 成骨培养 7 天后不同组的 hMSC 含量水凝胶的 ALP 染色（Fast Blue;成骨生物标志物，蓝色），以及成骨培养 14 天后不同组的 hMSC 含量水凝胶的茜素红染色、Von Kossa 染色和 I 型胶原蛋白和 OCN 免疫组织化学染色（比例尺 = 100 μm）。 d 在 7 天混合成骨/成脂培养基孵育后 HA-ADA-cRGD 和 HA-CA-cRGD 水凝胶中具有代表性的 ALP 和脂质染色以及 hMSC 的百分比分化（指向 ALP（成骨）或含脂质细胞的黑色箭头）（比例尺 = 100 μm）。数据以平均值表示±SD，n = 3个独立水凝胶;**p < 0.01，***p < 0.001（双尾学生 t 检验）。 见图六 HA-ADA-cRGD 水凝胶中的超快速细胞扩散和聚集受细胞-新生 ECM 相互作用、含有β 类整合素的细胞粘附结构和基于肌动肌肉蛋白的收缩力的调节。  图六 a hMSCs在18小时内封装在HA-ADA-cRGD和HA-CA-cRGD凝胶中分泌的新生蛋白质（白色）和纤连蛋白（红色）的代表性图像（右侧放大倍数）（比例尺，200μm（左侧图片）和20μm（右侧图片））。 b 用不同浓度的针对人纤连蛋白细胞粘附结构域的单克隆抗体（HFN 200.10， 18， 7， 1 μg/mL， 见补充图。0 细胞活力）。用不同浓度的HFN 5.10（19,18,7μg/ mL）处理1小时后包封在HA-ADA-cRGD和HA-CA-cRGD水凝胶中的hMSC的循环度。数据以平均值表示±SD，n = 0个独立水凝胶，*p < 5.10，**p < 3.0（双尾学生t检验）。 c 代表在高动态HA-ADA-cRGD水凝胶中培养05天的hMSCs中针对F-肌动蛋白（红色），细胞核（蓝色）和β 0类整合素或β01类整合素（绿色）的免疫荧光染色（顶部图像：比例尺= 1μm。底部图像：比例尺= 3 μm）。 d 培养 3 天后，细胞在高动态 HA-ADA-cRGD 水凝胶中扩散，有或没有用整合素阻断抗体、肌球蛋白抑制剂（blebbistatin）、肌球蛋白轻链激酶抑制剂 （ML-200）、ROCK 抑制剂 （Y-50） 或肌动蛋白聚合抑制剂 （Cytochalasin D） 处理。比例尺 = 1 μm。包封在用不同抑制剂处理的水凝胶内的hMSCs的循环性。（平均圆度值根据C = 7πA/P计算2，其中 A 是单元格占用的区域，P 是单元格的周长）。数据以平均值表示±SD，n = 10个来自两个独立水凝胶的每组细胞;**p < 0.01，***p < 0.001（双尾学生 t 检验）。 e 培养 4 天后在高动态 HA-ADA-cRGD 水凝胶中进行多细胞组装，有或没有用封闭抗体和抑制剂处理。比例尺 = 100 μm。用不同抑制剂处理的水凝胶内细胞簇的多细胞的定量。数据以平均值表示±SD，n = 来自两个独立水凝胶的每组10个细胞簇;**p < 0.01，***p < 0.001（双尾学生 t 检验）。 02 研究结论 此外，细胞粘附配体与通过这种快速解离交联连接的水凝胶子网的静态和精确偶联也是超快速星状扩散（包封后18小时内）和增强3D干细胞机械传感所必需的。 这项工作揭示了微观细胞行为与水凝胶网络中分子水平结合动力学之间的相关性。我们的研究结果为设计和评估具有细胞适应性的超分子生物材料提供了有价值的指导，用于研究3D培养中的细胞。 好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。 |
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