【原】南京大学冯福德&化学所王树Angew.：线粒体-ROS激活的在癌细胞中合成三甲川菁！

崛步化学 2022-07-14 发布于北京

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研究内容

环境响应性原位合成分子荧光染料一直是一个非常具有挑战性的课题。

南京大学冯福德教授和中国科学院化学研究所王树研究员开发了一种光延伸策略，使用1-丁基-2,3,3-三甲基3H-吲哚衍生物作为唯一的前体，制备具有良好转化效率（高达81%）的三甲川菁，展示了自由基参与机制。进一步探索了一种线粒体扩展策略，在活细胞中原位合成三甲川菁。相关工作以“Intrinsic-Mitochondrial-ROS-Activated In Situ Synthesis of Trimethine Cyanines in Cancer Cells”为题发表在Angewandte Chemie International Edition上。

研究要点

要点1. 作者在温和条件下以三种方式一锅合成Cy3和Cy3.5 染料，包括：a) 光延伸，b) 诱导物延伸和c) 丝裂延伸，使用1-丁基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚衍生物(PreCy)作为唯一的前体。光延伸法是基于在有机碱如三乙胺(TEA)存在下，对PreCy（或去质子化的PreCy）进行LED光激活；诱导剂延伸法依靠自由基（例如，以氮/碳/氧为中心的自由基）或H2O2通过基于自由基的机制引发和驱动反应。而自由基和活性氧（ROS）能够在没有光的帮助下介导类似的反应。

要点2. 作者进一步探索了一种线粒体定向延伸策略，在活细胞中原位合成三甲川菁。细胞ROS依赖性为癌细胞优先表达的花青提供了基础。线粒体定向延伸方法描述了染料合成从烧瓶成功转化为由内源性线粒体ROS驱动的活细胞，从而减轻了对光或其他外部帮助的需求。

要点3. 作者应用了一种碘化前体作为一种内在的ROS激活的治疗诊断剂，整合了线粒体靶向三甲川菁合成、细胞成像和光疗。内在细胞ROS在原位三甲川菁合成中的关键作用为使用单一前体开发癌症治疗学和光动力疗法(PDT)提供了机会。

研究图文

图1. (a)光活化法合成Cy3.5-1、Cy3-2和Cy3-3。(b) 反应溶液在0~600分钟内的紫外/可见吸收光谱。CIndo-1=33.3 mM，CTEA=66.6 mM。(c) 反应溶液在t=0 h、环境光(0.5 mW cm-2, t=12 h)或黑暗(t=12 h)下的UV/Vis吸收光谱。(d) 不同激发波长的白色LED光在65℃照射5 min后反应溶液的A599值。CIndo-1=33.3 mM，CTEA=66.6 mM。反应样品用氯仿稀释150倍后进行吸收测量。每个误差条代表三个独立测量值的标准偏差（n=3，平均值±SD）。反应在空气（e）或氩气（f）下进行：65℃白光LED光照射(10 mW cm-2, 0-300 s)后反应混合物的照片。BR：明场；FL：LED 550 nm灯下的荧光。(g-h)分离的花青染料的归一化吸收和荧光光谱。

图2. (a) 通过HAT生成DPPH自由基参与自由基的示意图。(b) 含有Indo-1 (33.3 mM)、TEA (66.6 mM)和DPPH(0或33.3 mM)的反应溶液的UV/Vis吸收光谱。反应在37℃避光下进行0 h或12 h后进行吸收测定。(c) DPPH诱导的Cy3.5-1生成示意图。（d）在Indo-1到Cy3.5-1转换中提出的光延伸和诱导物延伸的合理机制。i2*表示光激发的i2。

图3. (a) 诱导剂(1~12)的化学结构和转化效率，包括自由基、自由基引发剂和过氧化物。(b) 在37℃黑暗条件下12小时诱导物延伸反应的A599值。(c) 使用ACVA(4)作为诱导剂在65℃下Indo-1的转化效率。(b-c) 每个误差条代表独立测量的标准偏差(n=3, 平均值±SD)。*对于t=0 h时的每种诱导延伸反应，在599 nm处的吸收信号是不可检测的。

图4. (a) 活细胞或分离的线粒体中Indo-1向Cy3.5-1转化的示意图。(b) 用Indo-1孵育1小时并用白色LED光照射（30或0分钟，50 mW cm-2）处理的HeLa细胞的CLSM图像。CIndo-1=0.1 mM。比例尺：50 μm。(c) 与50 mM NH4Cl、40 μM氯丙嗪、80 μM dynasore、200 μM染料木黄酮、40 μM诺考达唑或0.1% NaN3孵育1.5小时、用Indo-1处理1小时和白色LED处理的HeLa细胞的相对荧光强度光照射(50 mW cm-2)30分钟。在相等的细胞数和误差条中检测到的荧光强度表示相对强度测量值的标准偏差（n=3，平均值±SD）。(d) HeLa细胞的CLSM图像。将细胞与Indo-1(0.1 mM)一起孵育1小时，洗涤，用白色LED灯照射并在成像前染色。比例尺：10 μm。(e) 用Mitotracker和Indo-1处理的HeLa细胞的CLSM图像的3D层扫描。含有或不含有分离线粒体的Indo-1(0.2 mM)溶液的荧光光谱(f)和荧光强度(g)。将混合物用白色LED灯（25 mW cm-2）在37℃照射10 min，或在测量前继续在黑暗中静置24 h。每个误差条代表独立实验的标准偏差（n=3，平均值±标准差）。

图5. (a) Cy3-3通过线粒体定向延伸、荧光反应和活细胞中的1O2致敏作用的细胞内效应示意图。(b) 以1分钟间隔用LED灯(550 nm, 5 mW cm-2)照射的溶液的荧光强度，并在488 nm激发下在甲醇中以534 nm记录。CCy3-3=5 μM，CDCFH=40 μM。误差线代表独立测量的标准偏差(n=3, 平均值±SD)。(c) 550 nm激光在D2O中激发Cy3-3后1O2的磷光。(d) 与Indo-3 (10 μM)在黑暗中预孵育12小时并用Mitotracker染色的HeLa细胞的CLSM图像。比例尺：5 μm。(e) HeLa细胞的CLSM图像，用Indo-3（0或50 μM）预孵育12小时，有或没有光处理并用JC-1染色。比例尺：5 μm。(f) 与Indo-3(25 μM或50 μM)预孵育12小时，光照射(550 nm, 25 mW cm-2, tirr=5, 15和30分钟)并再孵育24小时的细胞活力H。(g) 与Indo-3 (50 μM)预孵育12小时，光照射并再孵育24小时。(f-g) 误差线代表独立MTT测量的标准偏差(n=3, 平均值=SD)。