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（1.中国中医科学院 医学实验中心，北京 100700；2. 广东药科大学 中医药研究院广东省代谢性疾病中西医结合研究中心，广州 510006） 2型糖尿病是以高血糖和脂代谢异常为特征的慢性代谢性疾病，随着糖尿病在各人口大国的患病率和死亡率逐渐上升，已成为严重威胁人类健康的疾病之一。流行病学研究表明，心血管疾病是糖尿病的主要并发症，是糖尿病患者致死的首要原因，约60%的糖尿病患者死于心血管并发症。内皮功能紊乱是导致糖尿病心血管并发症的主要原因，血管内皮细胞衰老在其中发挥关键作用。体内外高糖、高脂环境通过氧化应激和炎症反应诱导内皮细胞衰老，随之获得衰老相关分泌表型，活化和分泌大量炎症细胞因子，促进血管慢性炎症扩散、单核细胞累积和血栓形成，加速血管内皮功能紊乱和糖尿病心血管并发症形成。中药人参、三七、川芎属于益气活血中药的范畴，药理学研究显示，上述3种中药的有效成分均具有较好的抗衰老功效，并且还具有扩张血管、逆转动脉粥样硬化斑块、保护血管内皮细胞、调节血管活性物质以及促进血管新生等作用。综上，探讨高糖高脂环境下血管内皮细胞衰老的病理机制，对糖尿病及心血管并发症的研究具有重要意义。目前研究多集中在高糖或高脂导致的血管内皮功能紊乱或者损伤。本课题组前期研究的基础上，通过构建高糖高脂诱导的血管内皮细胞衰老模型，探讨人参-三七-川芎提取物能否延缓细胞衰老，为糖尿病及心血管并发症的治疗提供新思路。 1材料 1.1 细胞 人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells，HAEC，批号6100），购自美国Sciencell公司。 1.2 药物及试剂 人参、三七、川芎合剂冻干粉，北京因科瑞斯医药科技公司制备提供。药物为道地药材，按2:3:4比例破碎成粗粉，经过醇提、浓缩、真空减压制成干膏粉，最终每克冻干粉相当于生药4.286 g，使用时以DPBS配制成10 g·L-1的贮存液，以0.22 μm的滤器过滤分装，保存于－20 ℃冰箱中。内皮细胞培养基、胎牛血清、内皮细胞生长因子、青霉素/链霉素溶液、胰酶消化液、细胞冻存液(美国Sciencell公司，批号分别为1001,0025,1052,0503,0103,0133)；D-glucose，棕榈酸钠（美国Sigma公司，批号分别为SLBR0902V，SLBV2022）；无脂肪酸BSA（d-BSA）（北京索莱宝科技有限公司，批号1206F052）；细胞活性和细胞增殖检测（CCK-8）试剂盒(日本同仁化学研究所，批号LG615)；细胞衰老β-半乳糖苷酶检测试剂盒，线粒体膜电位检测试剂盒JC-1（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C0602，C2006）；MitoSOX RED荧光探针（美国Thermo公司，批号1906247）；p-H2A.X（Ser139）兔单克隆抗体（美国CST公司，批号9718）；p21兔单克隆抗体，p16兔单克隆抗体，山羊抗兔IgG H＆L（Alexa Flour488）（英国Abcam公司，批号分别为ab109199，ab51243，ab1500777）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZB-2301）。 1.3 仪器 AE2000型倒置相差显微镜及成像系统（中国麦克奥迪实业集团有限公司）；Forma 370型细胞培养箱（美国Thermo公司）；Synergy H1型全自动酶标仪（美国Bio Tek公司）；FV1000型激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型电泳槽系统，PowerPac universal power supply型通用电泳仪电源，Trans-blot sp cell型半干转印槽（美国Bio-Rad公司）。 2方法 2.1 HAEC细胞培养 HAEC细胞培养于含5%胎牛血清、内皮生长因子、青霉素/链霉素（100 U·L-1/100 mg·L-1）的完全培养基，于饱和适度的5%CO2培养箱37 ℃培养，2~3 d换液1次。培养至细胞密度在80%~90%左右，按照1:2或1:3继续传代培养。棕榈酸钠溶于DPBS（95℃助溶）配成20 mmol·L-1溶液，将d-BSA按质量/体积溶于DPBS(55℃助溶)配成20%d-BSA溶液，将棕榈酸钠趁热加入到等体积的d-BSA中，配成10 mmol·L-1的棕榈酸钠（含10%d-BSA）存储液，4 ℃保存备用。 2.2高糖高脂诱导细胞衰老模型建立及分组 高糖/高脂培养基模拟2型糖尿病状态，本实验用不同浓度D-葡萄糖和棕榈酸钠诱导HAEC衰老，根据文献报道，结合前期预实验结果细胞形态、细胞增殖能力、细胞衰老染色检测评估细胞衰老程度，筛选出高糖高脂诱导细胞衰老的最佳造模浓度，然后用不同浓度人参-三七-川芎提取物处理细胞。实验分为空白组别、模型组（40 mmol·L-1葡萄糖+100 μmol·L-1棕榈酸钠）和中药低、中、高剂量组（50,100,200 mg·L-1），药物均用ECM完全培养基稀释，干预48 h。 2.3指标检测 2.3.1 细胞增殖能力 本研究采用CCK-8检测细胞增殖能力。细胞5×103个/孔接种于96孔板，每组设立6个复孔，待细胞贴壁后，每组进行相应的处理，处理48 h后，向每孔内加入CCK-8液10 μL，置于37 ℃培养箱中孵育2~3 h，于酶标仪450 nm波长处检测吸光度A。 2.3.2细胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色 待测细胞以2×104个/孔接种于24孔板中，细胞贴壁后，吸除细胞培养液，用DPBS洗涤1次，每孔加入SA-β-gal 250 μL染色固定液，室温固定15 min后，吸除细胞固定液，用DPBS洗涤细胞3次，每孔加入250 μL染色工作液，置于无CO2的37 ℃培养箱中孵育过夜。倒置光学显微镜下观察并计数，计算蓝染细胞数量占视野内总细胞量的比例。 2.3.3 免疫荧光检测 根据实验设计各组细胞进行相应处理后,吸除培养液，DPBS清洗2遍,每次5 min，4%多聚甲醛常温固定15 min，DPBS清洗3遍，每次5 min；再用0.1%Tritonx-100通透10 min，DPBS清洗3遍；加入5%BSA封闭液37 ℃封闭1 h；弃去封闭液后加入p-H2A.X一抗(1:500稀释)，4 ℃过夜；次日用DPBS清洗3遍后，加入荧光标记二抗（1:1 000稀释），37 ℃避光孵育1 h；DPBS清洗3遍，加DAPI室温孵育5 min；DPBS清洗3遍，加DPBS置于共聚焦显微镜下观察。 2.3.4 线粒体ROS(mtROS)检测 采用Mito SOX RED荧光染色法测定细胞内mtROS水平。细胞进行相应处理后，DPBS清洗2遍，按照mtROS检测说明书加入 Mito SOX RED 5 μmol·L-1，37 ℃避光孵育10 min，DPBS清洗2遍，置于共聚焦显微镜下观察。 2.3.5 线粒体膜电位(MMP)检测 MMP检测是以JC-1为荧光探针，能快速灵敏地检测细胞内MMP变化。细胞进行相应处理后，加入等体积的细胞培养液和JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育20 min，预冷的JC-1染色缓冲液洗涤2次，置于共聚焦显微镜下观察并记录结果。正常情况下，细胞的MMP较高，JC-1荧光探针聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；当MMP降低时，JC-1荧光探针不能聚集在基质中，不能形成聚合物，产生绿色荧光。 2.3.6 蛋白免疫印迹（Western blot）检测衰老相关蛋白p16，p21蛋白的表达按照RIPA蛋白抽提试剂说明提取各组总蛋白，经BCA法测定蛋白含量后调整蛋白浓度，加入5×SDS上样缓冲液，99 ℃变性5 min；12%SDS-PAGE电泳后半干转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，1:2 000稀释一抗4 ℃过夜；TBST清洗3次，每次5 min，1:3 000稀释二抗后室温孵育1 h；TBST清洗3次，每次5 min，化学发光法（ECL）显示目的条带。采用Image Lab图像分析系统对条带灰度值进行分析，并以β-actin为内参照。 2.4统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计处理，数值以`c±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。 3方法 3.1对HAEC细胞增殖能力的影响 通过各组CCK-8检测比较发现，与空白组比较，高糖高脂干预48 h可明显抑制血管内皮细胞的增殖（P<0.01）；与模型组比较，益气活血药可明显促进细胞的增殖，并且呈剂量依赖性升高（P<0.01）。见表1。 表 1 人参-三七-川芎提取物对HAEC细胞增殖能力的影响（`c±s,n=6） Table 1 Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on HAECcell viability（`c±s,n=6）
注：与空白组别比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P﹤0.05，4)P﹤0.01(表2-3同) 3.2对HAEC细胞衰老SA-β-gal染色的影响 各组SA-β-gal细胞衰老染色比较，高糖高脂模型组SA-β-gal蓝色染色比例显著增加（P<0.01）；50，100，200 mg·L-1人参-三七-川芎提取物处理后均可减低SA-β-gal蓝色染色的阳性比例（P<0.01）。见图1，表2。 A.空白组；B.模型组；C.人参-三七-川芎提取物低剂量组；D.人参-三七-川芎提取物中剂量组；E.人参-三七-川芎提取物高剂量组（图2同） 图 1 人参-三七-川芎提取物对HAEC细胞SA-β-gal染色的影响（SA-β-gal，×200） Fig.1 Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on SA-β-gal staining of HAEC（SA-β-gal staining，×200） 表 2 益气活血药对HAEC SA-β-gal染色的影响（`c±s,n=3） Table 2 Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on SA-β-gal staining of HAEC（`c±s,n=3）
3.3对HAEC衰老相关蛋白p16，p21的影响 与空白组比较，模型组HAEC p16，p21蛋白含量升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，益气活血人参-三七-川芎提取物组中p16，p21蛋白表达含量明显下降（P<0.05，P<0.01）。见图2，表3。 图 2 HAEC衰老相关蛋白p16，p21蛋白表达电泳 Fig.2 Electrophoresis of protein p16 and p21 of HAEC 表 3 人参-三七-川芎提取物对HAEC衰老相关蛋白p16，p21的影响（`c±s,n=4） Table 3 Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on senescence-associated protein p16 and p21 of HAEC（`c±s,n=4）
3.4 对HAEC DNA双链损伤的影响 为了进一步探索高糖高脂诱导细胞衰老的具体机制及人参-三七-川芎提取物的干预作用，本实验选择益气活血药最佳剂量200 mg·L-1进行后续研究。H2A.X是DNA双链损伤的生物标记物，参与多种因素诱导的细胞衰老过程。激光免疫共聚焦显微镜观察结果显示，高糖高脂组内p-H2A.X（Ser139）表达水平较正常组细胞增高；与模型组比较，益气活血药处理48h后，可明显降低细胞内p-H2A.X（Ser139）的水平。见图3。 A.空白组；B.模型组；C.人参-三七-川芎提取物组（200mg·L-1）（图4，5同） 图 3 人参-三七-川芎提取物对HAEC DNA双链损伤的影响 Fig.3 Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on double-stranded DNA of HAEC 3.5 对HAEC线粒体ROS和线粒体膜电位的影响 为了进一步探索人参-三七-川芎提取物延缓高糖高脂诱导内皮细胞衰老的机制，本研究检测线粒体膜电位和mtROS的生成。结果显示高糖高脂刺激可导致mtROS生成增加，人参-三七-川芎提取物干预后可减低细胞内mtROS含量，见图4；与正常组比较，模型组红色荧光比例明显下降，人参-三七-川芎提取物组红/绿荧光比例升高，提示高糖高脂可降低线粒体膜电位水平，人参-三七-川芎提取物干预可提高线粒体膜电位水平，见图5。 图 4 人参-三七-川芎提取物对HAEC线粒体ROS的影响 Fig.4 Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on mitochondrial ROS of HAEC 图 5 人参-三七-川芎提取物对HAEC线粒体膜电位的影响 Fig.5 Effect of extract of Ginseng, Sanqi and Chuanxiong on mitochondrial membrane potential of HAEC 4讨论 血管内皮细胞是血管系统与血液之间的重要屏障，通过合成和释放多种活性物质调节血管功能，在维持血管稳态中发挥重要作用。越来越多证据表明，血管内皮细胞衰老在内皮功能失常及相关性血管疾病中发挥重要作用。糖尿病患者长期处于糖脂代谢紊乱的状态，高糖和高脂刺激可导致血管内皮细胞不断分裂而进入衰老期，造成血管内皮完整性丧失和功能紊乱，促进血管并发症的形成。本研究采用葡萄糖联合棕榈酸共同处理HAEC细胞后，证实了高糖高脂环境可加速血管内皮细胞的衰老进程，表现在细胞增殖能力下降，SA-β-gal蓝染比例增加和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16和p21表达水平升高。 中医理论认为气血是构成人体的最基本物质，是脏腑经络等组织器官进行生理活动的物质基础。气血虚衰，血脉不通是衰老的危险因素，如《灵枢·天年篇》曰:“血气虚，脉不通，真邪相攻，乱而相引，故中寿而尽也”，其认为机体气血旺盛，循环不息则健康长寿，反之则早夭。中药人参、三七、川芎属于益气活血中药的范畴，在心脑血管疾病的中医治疗中被广泛的应用。三味中药联合应用，则可达到益气活血、通脉活络、延年益寿的功效。本研究结果显示，益气活血药各组均可以促进细胞增殖，减少SA-β-gal蓝染细胞数量，并降低p16和p21表达水平，提示益气活血药有效延缓高糖高脂诱导的内皮细胞衰老，可能为糖尿病及心血管并发症的治疗提供有效的方法。 研究表明，线粒体是细胞内ROS产生的主要场所，诸多因素如钙离子超载、氧化应激过度、能量耗竭都会造成线粒体受损，加速细胞内ROS的累积，过量的ROS能直接损伤DNA，使DNA链聚积、烷化断裂，导致基因序列改变、基因突变，加速细胞的衰老。实验结果显示，葡萄糖和棕榈酸处理48h后，内皮细胞线粒体膜电位水平下降，mtROS生成增加，并伴随DNA双链损伤的生物标记物p-H2A.X表达的增加，表明高糖高脂刺激损伤了内皮细胞的线粒体，加速细胞内ROS的生成，造成了DNA损伤累积，成为诱导内皮细胞衰老的主要原因。而与高脂高糖模型组比较，益气活血药组细胞内线粒体膜电位水平升高，mtROS生成减少，p-H2A.X表达水平下降。以上结果提示，益气活血药可能是通过保护线粒体，减少ROS引起DNA的损伤累积，从而达到延缓内皮细胞衰老的作用。 综上所述,益气活血中药人参-三七-川芎提取物能够延缓高糖高脂引起的血管内皮细胞衰老，其机制可能与升高线粒体膜电位，减少ROS生成引起的DNA损伤累积有关，这为T2DM及心血管并发症的治疗提供新的治疗思路。 |
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