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大家好，今天和大家分享的是近日，德国BioMed X研究所Jan Mauer教授团队和英国肯特大学Benja min Thomas Goult教授团队合作，在Journal of Cell Biology上发表了以 “ TLN1 contains a cancer-asso ciated cass ette exon that alters talin-1 mechano sensi tivity ” 为题的最新研究成果。该团队通过对来自癌症基因组图谱（TCGA）的泛癌症RNA-Seq数据集进行生物信息学前mRNA剪接分析。 01 研究背景 来自癌症基因组图谱 （TCGA） 的泛癌 RNA-Seq 数据集的生物信息学前 mRNA 剪接分析揭示了 TLN1 中可靠转录的未记录的 mRNA 序列（Gallego-Paez 和 Mauer，2022 年）。 该区域包含一个额外的非注释外显子，位于外显子17和18之间，我们称之为外显子17b。序列分析显示，外显子17b编码将17个氨基酸在帧内插入R2螺旋束的第一个螺旋中。尽管外显子17b可以很容易地在许多健康组织中检测到，包括皮肤和胰腺，但这种新型TLN1外显子在某些分子癌症亚型中显着富集。 此外，TLN1外显子17b的存在与癌细胞系中药物反应的改变和基因依赖性的变化相关，这表明在癌症生理学中起作用。在这份报告中，我们表征了这种新的talin剪接变体，并表明TLN1基因比最初想象的要复杂。将17b盒式外显子包含在TLN1 mRNA中为细胞响应信号改变机械转导提供了一种以前未被识别的机制。 见图一 非注释TLN1盒式外显子的差分拼接。  图一 （A） 原理图显示了 DJExpress 差分拼接分析流水线的工作流程（DJE = 差分结表达式）。 （B）通过对癌症患者和健康对照的差异剪接分析，在TLN1中发现一种新的盒式外显子。使用DJExpress管道生成的TLN1 mRNA的基因剪接图有助于鉴定两个差异表达的非注释连接，表明在几种癌症类型中外显子18和20之间存在外显子包涵体事件（连接17-18）。显示了来自乳腺癌浸润癌 （BRCA）、宫颈鳞状细胞癌 （CESC）、结肠和直肠腺癌 （COADREAD） 和来自癌症基因组图谱 （TCGA） 的肺腺癌 （LUAD） 癌组织的代表性剪接图与来自基因型组织表达 （GTEx） 数据库的正常组织的比较。黑色箭头表示反向链上TLN1转录的方向。x轴上的数字表示基因中的第一个，最后一个和差异表达的连接。圆圈表示在全长 TLN1 转录本中检测到的所有连接。显著下调和上调结点与 |logFC|上述截止值和罗斯福<0.05分别以蓝色和红色显示。绝对或相对logFC（或两者）的FDR>0.05的交汇点以黑色显示。灰色区域表示对数折叠更改截止值（|logFC| > 1.0）。 （C）显示TLN1交替拼接区域的示意图。组成外显子17和18以蓝色显示。连接点18和20的存在表明包含17个氨基酸（AA）盒式外显子17b（红色），而连接点19的存在表明外显子17b排除。（D–F）TLN17 mRNA中的非注释外显子1b在健康组织中具有可变的表达水平，并跨癌细胞系使用。 （D） 显示 GTEx 健康组织中 TLN1 外显子 17b 的拼接百分比 （PSI） 值的箱线图。PSI 值的范围为 0.0–1.0，其中值 1.0 表示 100% 拼接。虽然在许多健康组织类型中不存在，但外显子17b在某些组织中高度富集，包括皮肤和胰腺。 （E）显示跨癌细胞系（CCLE）的TLN1外显子17b的PSI值的箱线图。 （F） 箱线图显示 TCGA BRCA 乳腺癌肿瘤样本 PAM1 亚型中 TLN17 外显子 50b 的 PSI 值（* P 值≤ 0.01;** P 值≤ 0.0001 与基础亚型，单因素方差分析）。 见图二 TLN1外显子17b包入与癌细胞系中的药物反应和基因依赖性改变有关。  图二 （A）在癌细胞系中检测到TLN1外显子17b的差异剪接。箱线图显示了肺癌、结肠癌和乳腺癌细胞系中 TLN1 外显子 17b 的剪接百分比 （PSI） 值的分布。单独标记的BT20、ZR751、MDA231和BT549乳腺癌细胞系用于B. （B）RT-PCR验证四种代表性乳腺癌细胞系中TLN1外显子17b表达的RT-PCR验证。RT-PCR使用外显子17b侧翼的引物进行（引物位置由黑色箭头表示）。外显子17b跨越51个碱基对（bp），外显子17b包入导致扩增子大小从183 bp增加到234 bp.BT20和ZR751细胞系显示外显子17b包涵体，而MDA231和BT549细胞系显示外显子17b跳跃。 （C）TLN1包涵体连接（18,20）和跳跃连接（19）的表达与使用DepMap药物敏感性数据在所有癌细胞系中进行药物治疗后的细胞存活相关。使用排名最高的相关系数（FDR < 0.05 和 |rho| > 0.2）来构建SpliceRadar图。TLN1外显子17b包涵体（红色和深红色线）和排除（蓝线）连接表达与药物治疗后细胞存活率的相关系数作图。数据表明，外显子17b的包含与对EGFR抑制剂的敏感性增加（蓝框）和对靶向PI3K-Akt和细胞骨架组织的药物（红框）的耐药性有关。黑色虚线表示相关系数 R = 0，R 范围为 −0.5 到 0.5。 （D）与癌细胞系中TLN1外显子17b包含相关的DepMap基因依赖性的KEGG基因集富集分析（GSEA）。富集图显示了代表性最高的途径，包括细胞粘附、细胞骨架组织（红色）和EGFR/ErbB信号通路（蓝色）。点大小表示每个KEGG通路中富集的基因数，颜色梯度表示调整后的P值的显著性水平。 （E）TGF-β/EGF联合治疗促进TLN1外显子17b以SMAD3和PCBP1依赖性方式跳跃。HeLa细胞中TLN1连接表达的基因剪接图，显示外显子17b的基线包含。左图：TGF-β/EGF联合处理导致HeLa细胞中的外显子17b跳跃。中图：shRNA介导的TGF-β信号换能器SMAD3的敲低阻断了TGF-β / EGF诱导的HeLa细胞中外显子17b的跳跃。右图：shRNA介导的RNA结合蛋白PCBP1的敲低阻断了HeLa细胞中TGF-β / EGF诱导的外显子17b跳跃。（图中所示的图是由基于DJExpress的RNA-Seq数据重新分析GSE72419生成的;灰色区域表示对数倍变化临界值（|logFC| > 0.5）。外显子17b夹杂结显示为红色，外显子17b跳跃结显示为蓝色。绝对或相对logFC（或两者）的FDR>0.05的交汇点以黑色显示。黑色箭头表示反向链上TLN1转录的方向。 见图三 外显子17b在蛋白质水平上的结构分析。  图三 （A）显示TLN17蛋白中1b插入（红色）在R1（蓝色）和R2（橙色）之间的位置的卡通。 （B）R1R2-WT和R1R2-17b区域的序列比对，显示R17区域（橙色）中的2个残基插入（红色），插入两侧的残基Q665和D666分别以洋红色和绿色突出显示。 （C 和 D）R1R2-WT的晶体结构（蛋白质数据库加入号）1SJ8）.与 B 中相同的配色方案用于 R1（浅蓝色）、R1-R2 链接器（蓝色）和 R2（橙色）。 （D）放大R1-R2接头（蓝色）的区域，显示R665第一螺旋中Q666（洋红色）和D2（绿色）之间的插入位点的位置。（E 和 F）R1R2-17b的AlphaFold模型。 （E）17b插入以红色显示。 （F）放大与D相同的区域视图.突出显示17b插入物两侧的残基Q665（洋红色）和D666（绿色）。R1的最后一个螺旋被扩展为包含部分蓝色接头区域，但R2的第一个螺旋被缩短。 （G） 全长TLN1的冷冻电镜结构（蛋白质数据库加入号.6R9T [Dedden等人，2019]）与R1R2-17b的结构模型重叠，表明插入延伸出自抑制单体状态。 （H） R1R2-WT 和 R1R2-17b 重组蛋白的 SDS-PAGE。 见图四 外显子17b改变了R1R2的生物物理、生化和机械性能。  图四 （A）使用16μM蛋白质进行圆二色性（CD）分析。通过监测CD在1nm处随温度升高的变化来测量R2R1-WT（蓝色）和R2R17-222b（红色）的变性曲线。野生型R1R2的熔化温度（Tm）为77°C，而R1R2-17b在64°C时展开。 （B-D）表征R1R2-WT和R1R2-17b与RIAM和粘着蛋白的相互作用。（B） 使用Superdex-1凝胶过滤柱通过尺寸排阻色谱（SEC）分析黏着活性蛋白结构域1（VD200）结合。VD1（V）与talin（T），R3R1-WT（蓝色）或R1R2-1b（红色）在2°C下以17：37的比例孵育。R1R2-WT观察到最小的结合。然而，观察到R1R2-17b的广泛络合，并且观察到1：2和1：3的复合峰。计算出的两个复合峰的分子量分别为∼80和∼110 kD。 （C 和 D）通过核磁共振分析的RIAM与R1R2结合。1H，15N TROSY 光谱单独 100 μM R1R2-WT（黑色）和 R1R2-17b（蓝色），并加入 300 μM RIAM 肽（[C] 中绿色，[D] 中红色）。在两个版本中都观察到广泛的化学位移变化，确认RIAM与两个版本的相互作用。 （E 和 F）单分子拉伸实验表明，17b夹杂物改变了R1和R2的力学稳定性。实验设置显示在 E 的插图中。R1-R3-WT（E）和R1-R3-17b（F）的单个分子被拴在顺磁性微珠和盖玻片之间。左图：在1 pN s−1的加载速率下重复力增加扫描期间微珠高度的代表性时间轨迹。每增加一个逐步磁珠高度，都表示一个域的展开。通过不同的颜色迹线显示五个独立的力增加扫描。右图：R1-R3-WT（N = 353，七个独立系绳）和R1-R3-17b（N = 391，九个独立系绳）展开力的归一化直方图。虚线表示野生型 R1-R3 中每个域的展开阈值。 见图五 TLN1外显子17b亚型改变细胞中的局灶性粘附。  图五 （A） Tln1−/−/Tln2Si MEFs中粘连的代表性图像，表达在不同电镀时间与粘着蛋白共染色的全长talin-1 WT和外显子17b剪接变体。比例尺，5 μm。 （B）A中长春菌素与他林-1比率的定量。数据是平均±SEM，N = 290-1,987粘附。 （C）A.数据中FA区域的量化是3,196-4,658个粘附±SEM平均值。 （D）A.数据中焦点粘附数的量化±25-60个细胞的SEM平均值。 （E）细胞面积的量化。数据是 SEM ±平均值。N = 3。 （F）表达全长talin-1 WT或外显子17b剪接变体的细胞的迁移速度。数据是 SEM ±平均值。N = 10 个单元格。 （G）表达全长talin-1 WT和外显子2b剪接变体的Tln1−/−/Tln17Si MEFs中FRAP实验的代表性图像。盒装区域表示漂白的 FA。比例尺，1 μm。 （H）将GFP-talin-1在单个局灶粘连中的分数恢复百分比与时间作图。数据是 SEM ±平均值。N = 10 个细胞/样本。 （I） 表达全长 talin-1 WT 和外显子 2b 剪接变体与张力蛋白-1 共染色的 Tln17−/−/Tln1Si MEF 中局灶粘连的代表性图像。比例尺，5 μm。 （J）定量细胞中央和外周他林粘附内张力蛋白-1平均荧光的比率。数据是 SEM ±平均值。N = 52–84 个单元格。通过加扰和击倒条件（B-E、F、H 和 J）之间每个时间点 （B-E） 的单因素方差分析 （ANOVA） 计算统计显著性。*， P < 0.05;**， P < 0.01;， P < 0.0001。 02 研究结论 总之，我们报告了在TLN17基因中发现的新型盒式外显子1b，它改变了talin-1蛋白编码序列。这种盒式外显子已经可以在健康组织中检测到，但在几种癌症亚型中高度富集。此外，TLN1外显子17b的剪接可以通过TGF-β信号通路进行控制。 好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。 |
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