【原】新品预告｜基于WGS无偏分析CRISPR基因编辑脱靶检测

基因编辑的开发与应用使得生物体的遗传改造进入了前所未有的深度和广度，其临床转化在全球范围内高速推进，作为生命医学领域的革命性技术，在快速推进的过程中，需对相关的生物学安全性进行有效评估。

基因编辑技术主要包括ZFN技术、TALEN技术、CRISPR/Cas技术，与ZFNs和TALENs技术相比，CRISPR系统是轻量级的基因编辑系统，可对基因进行定点的精确编辑，被Nature杂志列为2013年年度十大科学进展之一，虽然CRISPR/Cas9问世时间较短，但以其为代表的CRISPR技术或将主导基因编辑产业化的未来。不过，由于单链向导RNA（sgRNA）本身具有一定容错能力（研究表明，sgRNA自身可耐受多个碱基的连续错配），导致基因组上sgRNA同源序列可能发生编辑事件，造成不同程度的非目的基因组编辑风险，也就是脱靶。

《人源干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》和《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》中都要求基因编辑产品进行脱靶风险评估，建议使用包括无偏全基因组分析在内的多种方法识别脱靶位点并证明未发生脱靶。

对干细胞进行基因组编辑的产品，应分析和研究基因修饰细胞中的脱靶编辑情况，建议使用包括无偏全基因组分析在内的多重正交方法(例如，计算机、生化、细胞分析方法)识别潜在的脱靶位点。

——《人源干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》

虽然采用计算机分析预测基因编辑的潜在脱靶位点，并对潜在脱靶位点进行深度测序分析，可用于评估基因编辑的脱靶风险；但选择的评价策略仍应包含体外全基因组测序比对，以证明潜在脱靶位点未出现脱靶。

 ——《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》

CRISPR全基因组脱靶分析

阅微基因开发基于全基因组技术对CRISPR基因编辑产品进行脱靶分析服务（流程见图1）。通过对编辑前后样本进行30~50x全基因组测序及数据比对，无偏检测基因编辑导致的SNPs、InDels，染色体水平的结构变异事件，并通过分析sgRNA同源区域识别出可能的脱靶位点。

图1 全基因组脱靶整体分析流程图

表1 生物信息分析

生信分析示例

表2 同源脱靶信息

表3 脱靶变异注释

图2 同源序列中碱基的保守性展示

图3 脱靶变异位置展示

全基因组脱靶分析作为一种直接的检测技术，能够对基因编辑导致的整体变异进行更全的综合评估，包括预测的脱靶区域外的分析统计。

阅微基因——生物药第三方一体化服务，在CGT领域具有丰富的项目经验，提供高品质的实验室检测服务。紧跟法律法规要求开发相关检测技术，如慢病毒插入位置分析，WGS菌毒种分析等，助力生物医药的快速发展。

向上滑动阅览参考文献

1.《人源干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》2023年

2. 《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》2021年

3.  Bae, S., Park, J., & Kim, J. S. (2014). Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics (Oxford, England), 30(10), 1473–1475.

4.  Kouprina N, Kim JH, Larionov V. Highly Selective, CRISPR/Cas9-Mediated Isolation of Genes and Genomic Loci from Complex Genomes by TAR Cloning in Yeast. Curr Protoc. 2021 Aug;1(8):e207

5.  Wu, X., Kriz, A. J., & Sharp, P. A. (2014). Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative biology (Beijing, China), 2(2), 59–70.

6.  Yin, J., Liu, M., Liu, Y. et al. Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing. Cell Discov 5, 18 (2019).

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