【神助攻系列】Cas9稳定表达细胞系

CRISPR-Cas9

CRISPR/Cas9基因敲除系统由有DNA切割活性Cas9蛋白及识别特异靶点的gRNA组成，由于只需对系统中的gRNA进行编辑就能实现靶点识别，极大了简化了构建基因敲除载体的工作。

CRISPR-Cas9 赋予我们精准编辑基因的能力

在 Google 学术上，CRISPR Cas9 相关的文献已经超过 51700 篇。

为何使用cas9的稳定表达细胞系

在哺乳动物细胞培养系统中，大多数基因组编辑都是通过瞬时转染或慢病毒转导来完成的，这对于常规的低通量应用来说是很有效的。

图 1. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图

然而，对于其他的应用，能够稳定表达其中一个组成部分，即CRISPR-Cas9核酸酶，会更加有效。

cas9 稳定细胞系应用

1)sgRNA功能验证;

2)使用慢病毒CRISPR进行基因敲除;

3)sgRNA文库筛选;

4)可诱导的基因组编辑。

应用1:sgRNA功能验证

单个sgRNAs本身的效率存在差异。在进行大量的筛选工作之前，需要确定哪些CRISPR sgRNAs能够更加高效的进行基因组编辑。

图 2. 通过IndelCheck™体系对 CRISPR sgRNAs功能验证实验流程。

收集经 CRISPR 或 TALEN 转染的细胞，并针对靶点序列设计引物，使用靶点 PCR 试剂盒（1）扩增经过 CRISPR/TALEN 扩增的靶点序列。所得的 PCR 产物经解链退火生成杂交 DNA 双链产物，其中部分部分可能存在错配，可以被 T7 核酸内切酶 I 试剂盒（2）酶切检出。如果 CRISPR/TALEN 对基因组的编辑功能是阳性的，错配酶切所产生的条带可以通过电泳跑胶观察到。

应用2:使用慢病毒CRISPR进行基因敲除

利用慢病毒介导CRISPR方法：

（1）一个慢病毒表达Cas9和sgRNA

（2）转导两种不同的慢病毒，一种表达Cas9，另一种表达sgRNA。

由于Cas9 ORF的体积较大(>4.4 kb)，“all in one”或“Cas9-only”慢病毒的滴度明显低于sgRNA-only慢病毒。

因此，GeneCopoeia建议，将表达cas9的稳定细胞系与表达sgRNA的慢病毒转导进而实现高效的基因组编辑。

应用3：sgRNA文库筛选

CRISPR sgRNA文库广泛应用于药物靶向识别和验证、表型变化和报告分析。CRISPR会对遗传密码进行永久性更改。因此，CRISPR可以完全敲除一个基因的所有等位基因，无论它们的转录产物是定位于细胞核还是细胞质。

图 3. 使用 GeneHero™ sgRNA 文库进行药物靶标研究的应用示例。 上：96孔板培养能稳定表达Cas9核酸酶的细胞系。中：使用 sgRNAs 文库（独立克隆文库或混合文库）对板上的 GeneHero™ Cas9 稳定表达细胞系进行转染或转导。下：对转染后的96孔板进行针对细胞死亡的筛选（图为黑孔）。每个sgRNA都带有barcode序列，因此相关的单个或多个sgRNA能被识别出来，列作药物靶标的候选。

应用4:可诱导的基因组编辑

诱导型CRISPR (iCRISPR)最早由Gonzalez等人(2014)证明，他构建了一个诱导多能干细胞(iPSC)模型细胞株，该细胞株携带Cas9，添加四环素诱导后才可以表达Cas9。文献如下：

Gonzalez, et al. (2014). An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 15, 215.Qiu, et al. (2004). Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36, 702.

所以

这么有用的cas9稳转株

哪里来？

* 70+ 种人类、小鼠、大鼠CRISPR-Cas9 稳定表达细胞系；

* 涵盖26+ 种不同癌症，如：肺癌、宫颈癌、乳腺癌、肝癌等细胞系。                 

* 通过safe harbor位点整合，确保 Cas9 稳定表达，同时对细胞无副作用。

* 可配合 sgRNA 克隆、sgRNA文库以及供体克隆服务 使用。

高分文献举例

Combinatorial CRISPR-Cas9 Metabolic Screens Reveal Critical Redox Control Points Dependent on the KEAP1-NRF2 Regulatory Axis. 2018. Molecular Cell, IF 17.819. A549 and HeLa Cas9--expressing stable cell lines.

Dissection and function of autoimmunityassociated TNFAIP3 (A20) gene enhancers in humanized mouse models. 2018. Nature Communications, IF 12.124.  293T Cas9-expressing stable cell line.