基于CRISPR-Cas9靶向基因组修饰技术的KI细胞系的建立

本文开讲前回顾下

CRISPR/Cas9有关内容

☑白友“冰糖”分享：CRISPR/Cas9系统操作实例；

☑CRISPR/Cas9系统操作实例分享之二：LentiCRISPR v2；

☑CRISPR/Cas9中gRNA的设计 & NgAgo编辑位点推测；

☑揍晕砖家系列：Cas9/CRISPR-同源重组修复(HDR)；

☑CRISPR技术简介

研究内容概述：

    假设要对H基因功能进行研究，通常情况下，是对实验组进行特殊处理后，观察实验组与对照组中H基因表达mRNA或者蛋白的情况，分析后推测其功能。用到的方法一般有RT-PCR、Western Blot、克隆目标基因启动子，构建报告基因表达载体等，但这些方法过程繁琐、费时费力，很难做到高通量筛选。

    而若采用CRISPR-Cas9介导的靶向基因组插入技术，建立H-Luciferse细胞系，就能通过检测Luciferase表达变化即可真实反映H基因的相对表达量及表达变化情况，具有方便快捷、安全直观的优点，能够通过Luciferase表达变化做到高通量筛选。

实验目的：

    采用CRISPR-Cas9介导的靶向基因组插入技术建立H-Luciferse细胞系，并通过一系列方法验证其正确性，将有助于H基因功能研究及筛选影响H表达的小分子化学药物，为H基因相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。

图1 CRISPR-Cas9介导的靶向基因组插入技术构建细胞系示意图

实验步骤

sgRNA的筛选：

    首先在目的基因H的终止密码子后的打靶区（TSF）设计sgRNA，并与表达Cas9蛋白的质粒共转染细胞（我们选用的是HEK293细胞，Cas9质粒量与sgRNA质粒量比例为2:1 ），来测试、筛选出能引导高切割效率的sgRNA。实验采用的是用T7E1酶来进行sgRNA打靶效率的检测。（检测结果事例见下图）

图2.sgRNA打靶效率的检测

构建打靶载体：

1、把筛选好的sgRNA与Cas基因构建在一个载体上，用于接下来的与供体载体共转。（也可以分两个质粒，按照Cas9质粒量与sgRNA质粒量比例为2:1来转染）

图3. Cas9/sgRNA 载体示意图

2、构建如下图的Donor载体，之后把Cas9/sgRNA载体和Donor载体（质量比为4μg:8μg）共同转染细胞（本实验使用HEK293细胞，60mm；使用磷酸钙转染），建立KI细胞系。

图4.CRISPR-Cas9介导的靶向基因组插入技术构建细胞系示意图

筛选细胞：

1、转染之后的细胞，分别加G418（针对Neomycin）和GCV（针对PGK TK）药物来筛选细胞（加完G418需要等到细胞状态稳定后，再加GCV）。

2、存活下来的细胞，可以观察其荧光情况（Donor带GFP和mcherry），并测定其luciferase的活性，等待接下来克隆化操作。

图5.克隆化操作前，观察细胞带绿色荧光情况

3、筛选细胞（有限稀释法）：之后进行细胞的克隆化，是基于有限稀释法的操作，希望得到成功KI的单个细胞培养成的细胞系。

图6.cas9介导的同源修复示意图

KI细胞系的鉴定：

    通过PCR后产物条带大小的检测来判断得到的细胞系是否需要继续克隆化。

图7.KI细胞系PCR鉴定示意图

KI细胞系功能验证：

    在通过了PCR、测序分析后，确定得到了KI的细胞系，接下来应该验证得到的细胞系是否有功能，以便能顺利进行接下来的实验。

    实验中是利用CRISPR/dCas9介导的转录激活或抑制系统来进行验证，如下图，利用sgRNA介导的dCas9-VP64/KRAB来对H基因的转录进行激活或者抑制。

图8.CRISPR/dCas介导的转录激活系统示意图

    对KI细胞系进行CRISPR/dCas9介导的转录激活或抑制操作为实验组，用相同系统操作的WT细胞为对照组，通过实验组测得的luciferase值与对照组H基因的Western Blot、RT PCR结果进行比较，即可确定构造的KI细胞系是否可以通过luciferase值来真实地反映H基因的表达情况。