稳转细胞系构建方法总结

说到稳转细胞系的构建，目前主流的方法肯定是慢病毒介导，该方法我们已经介绍了很多，本文不详细赘述。这里我们重点介绍除慢病毒以外的其他几种稳转细胞系构建方法，并对不同方法的优缺点做系统比较。

介导方法	载体容量	介导效率	时效性	优点	缺点
慢病毒系统	5kb	高	1-2周	快速高效	有生物安全风险
转座子系统	10kb	一般	3-4周	安全稳定	表达丰度一般
CRISPR敲入	5kb	一般	3-4周	定点整合	CAS9转导困难，成本高
质粒筛选	10kb	低	4-6周	成本较低	效率低且不稳定

慢病毒系统

     慢病毒构建稳转细胞系是目前最常规的稳转株构建方法，可以介导shRNA,过表达，CrispR，报告基因等等基因转导的需求，一般情况下经过1-2周的筛选，细胞即可实现稳转。建议初代建立好的细胞系大量冻存，后续实验培养尽量控制代数，且定期加入对应抗性做压力筛选，保持导入基因表达的稳定性。如果您做的是shRNA干扰细胞系，需要特别注意细胞系传代次数的问题，大量客户反馈表明，shRNA干扰稳转系在超过10次传代之后，干扰水平会显著降低，这可能和细胞的代谢补偿及导入序列被甲基化修饰导致的。

转座子系统

    如上图，我们以PiggyBac（PB）转座子为例来介绍一下转座子系统介导的细胞系稳转系统。转座子的出现为构建基因编辑细胞株提供了一个全新的视野。转座子也被称为跳跃基因，由Barbara McClintock教授在上世纪50年代发现，是指一段DNA序列由基因组的一个位置跳跃到另一个位置。

转座子主要包含两种类型：

a) I类转座子：逆转座子（retrotransposons），自身不表达转座酶，先转录为RNA，通过RNA的反转录获得cDNA，cDNA在整合酶的作用下转移到其他基因组位置。

b) II类转座子：DNA转座子（DNA transposons），通过自身编码的转座酶直接切割转座子所在DNA序列，实现序列的转移。以睡美人转座子（SleepingBeauty）和PiggyBac转座子等DNA转座子最为常见。

    PiggyBac转座子结构与作用机制PB是一种II类转座元件，最初来源于卷心菜环蛾（Trichoplusia ni），它特异性靶向DNA中的TTAA四核苷酸位点，PB转座子长度为2472bp，由PB转座酶（PBase）基因组成，该基因两侧有转座所需的末端重复序列。转座通过“剪切和粘贴”机制发生，在该机制中，PBase最初识别并结合转座子末端。然后，它将整个转座子从其原始位置切除，并通过一种不依赖于宿主因子的机制催化其插入另一个染色体位点。

     PiggyBac双载体系统及优点PB转座子衍生的双载体系统由（i）携带人工转座子的供体载体和（ii）驱动PBase表达的辅助载体组成，人工转座基因具有两侧为PB左右末端结构域的哺乳动物表达盒。使用PB系统获得哺乳动物细胞系有几个潜在的优点。

1. 实验方法安全简单，只需要将供体和辅助载体的共转染后筛选即可介导哺乳动物细胞中的高效外源基因整合；

2. PB整合位点的定位研究证明，PB有利于转座到宿主基因组的转录活性区域；

3. PB转座子可有效介导高达14kbp的DNA转座至宿主中；

4. PB转座可以整合目的基因的序列，从而降低非功能外源基因整合的概率；

5. 使用PB系统可将单个或多个基因持续表达；

6. 转座子效益是可逆的，如果单独转染转坐酶，外源基因的表达丰度会动态降低。

     在细胞房不满足慢病毒使用要求；基因较大包装慢病毒困难；细胞系在慢病毒感染时发生凋亡或变态；多基因高通量稳转的应用需求下，我们推荐使用转座子系统构建稳转细胞系。

CRISPR敲入系统

    CRISPR敲入系统一般来说有两种情况，一种是定点敲入，该方法的目的是引入定点突变，这里需要设计特定的sgRNA序列及特定的供体Donor序列。另外一种是固定位点的整合将外源基因导入到目标细胞内，常用的整合位点AAVS1（human）及Rosa26（mus），这里我们我们分别介绍两种方法的具体应用。

      如上图所示，实现CRISPR定点敲入需要3个要素，a.1条或多条目的位点的sgRNA，b.引入基因元件的DNA donor，c.在细胞内表达CAS9蛋白。crispr系统的基因敲入是概率事件，根据sgRNA位点及插入donor的差异，敲入效率并不是固定不变的，我们只能通过优化序列及介导效率去提高敲入的水平，最终还是要通单克隆分选，才能获得正确的定点敲入细胞株。关于上述3要素的递送方法，下表做详细的介绍。

类型	CAS9递送	sgRNA递送	供体片段（Donor）
A	CAS9稳转株	化学合成sgRNA+转染	质粒载体
B	CAS9慢病毒	sgRNA 慢病毒	dsDNA双链
C	CAS9腺病毒	sgRNA-CAS9 慢病毒	ssDNA单链（最佳）
D	CAS9 Cre-Loxp鼠	sgRNA表达质粒	Oligo寡核酸

不同的应用场景可搭配不同的递送方案，可咨询权阳生物的技术支持一对一分析。

       利用固定的整合位点AAVS1（human）及Rosa26（mus），定点插入外源基因。因为固定的整合位点是固定的sgRNA及donor序列，所有我们只需在donor的中间插入需要合成的外源基因序列，即可实现稳定的基因敲入目的。该方法的特定是定点整合，目标位置是已被证实的安全基因打靶位点，最大限度的降低基因导入对内源性基因表达的影响，结合特殊的递送载体，可实现外源基因的精准递送，例如在基因治疗相关领域的应用。

质粒筛选稳转细胞株

      该方法是最原始的细胞系构建方案，也不需要过多的说明，操作上只需要把目的质粒成功转染到细胞内，使用对应抗性长期筛选，也有一定概率获得稳转细胞株，稳定性和表达效率我们不做评价。

来源：权阳生物