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一、WB实验介绍 “ Western Blot WB（Western Blot，蛋白免疫印迹）是一种常规的蛋白分析技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。 WB实验的基本核心理念是抗原抗体的特异性反应，通过变性胶 SDS-PAGE 将不同分子量的蛋白质分离开，然后转移到固相载体 PVDF 膜上，再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。待目的蛋白和抗体充分结合后，用 TBST 洗脱液洗脱掉多余未结合的一抗，加入带有 HRP 标记的对应二抗，这样，我们的蛋白+一抗+二抗形成一个复合物，加以化学发光液，有靶蛋白的位置就会产生荧光，利用胶片或者化学发光仪就可以显现靶蛋白的条带显现。 WB常规实验流程：蛋白提取→蛋白定量→制胶→电泳→转膜→封闭→一抗孵育→一抗洗脱→二抗孵育→二抗洗脱→化学发光→数据分析。  WB实验流程图 （图片来自网络，侵联删） 二、WB实验试剂配置 在实验开始之前，可以按以下配方比例配置实验所需试剂。 1 电泳缓冲液 取 电泳缓冲液干粉，溶解于 1L 纯水中，置于磁力搅拌器上搅拌充分溶解。 2 转膜缓冲液 取 转膜缓冲液干粉，溶解于 800mL 纯水中，加入 200mL 的甲醇，置于磁力搅拌器上搅拌充分溶解。 3 TBST 缓冲液 取 TBS 粉剂，溶解于 2L 纯水中，加入 1mL 吐温20，置于磁力搅拌器上搅拌充分溶解。 4 5%脱脂牛奶 称量 5g 脱脂奶粉，溶解于 100mL TBST 溶液中，置于磁力搅拌器上搅拌至少 30分钟，然后放入 4℃冰箱暂放。 5 完全裂解液 1mL RIPA 裂解液+20μL cocktail+10μL磷酸化蛋白酶抑制剂 A+10μL 磷酸化蛋白酶抑制剂 B+10μL PMSF，除 RIPA 外，其他四种试剂使用前几分钟加入，现配现用。 三、WB实验步骤 由于文章篇幅限制，小编这次先介绍组织或细胞的蛋白提取和蛋白定量常规流程。 1 组织总蛋白提取 准备好所需要数量的样本管；放入研磨珠，置于冰盒上备用； 组织块先用预冷 PBS洗涤 2-3 次，除去血污，然后放在滤纸上，吸尽多余的 PBS 后放入对应的匀浆管中，加入大约 10 倍样本体积的完全裂解液，置于组织研磨仪中，对称放置，确认放置平衡后，盖好盖子，选择程序开始匀浆。 ① 芝麻大小的组织，一般加入100-200μL 完全裂解液；绿豆大小组织加入 400-600μL 完全裂解液；黄豆大小组织加入 800-1000μL完全裂解液。 ② 研磨仪参考参数：2mm 氧化锆珠 8-12颗，频率6.5m/s，时间30s。如果一次匀浆不彻底，可以再次匀浆）。如果组织块比较大，可提前用剪刀将组织块剪碎。 2 悬浮细胞提取蛋白 将细胞连带培养基一起吸入 15mL 离心管中，4℃，2000rpm，离心 5分钟，去掉上清； 加入 1mL PBS 溶液重悬细胞，将细胞转移到 1.5mL 离心管中，然后 4℃，2000rpm，离心 5分钟，去掉上清，保留沉淀，重复此步骤 2-3 次（此步骤目的为清洗细胞中残留的培养基）； 根据细胞沉淀的量加入适量的完全裂解液，例如沉淀体积为绿豆大小（大概 10uL 左右）的加入大约 200μL 完全裂解液，加入适量研磨珠，放入研磨仪进行裂解； 裂解完成后，12000rpm，4℃，离心 10分钟，上清即为总蛋白溶液。 3 贴壁细胞提取蛋白 倒掉培养基，沿细胞培养皿侧壁或者培养瓶瓶口慢慢加入 PBS 溶液，轻轻晃动平皿或者培养瓶，然后将细胞培养皿/瓶倾斜放置，用移液枪轻轻吸除残余液体，尽量轻柔，不要将细胞冲掉，清洗 2-3 次，最后一次将残余 PBS 完全吸干； 加入适当体积的完全裂解液（例如六孔板各单孔细胞长满的话，加入大约 250μL完全裂解液），反复晃动细胞培养皿/瓶，让裂解液与细胞完全接触，用细胞刮刀将细胞刮下来，收集后，加入研磨珠，放入研磨仪中进行裂解； 裂解完成后，12000rpm，4℃，离心 10分钟，上清即为总蛋白溶液。 取适量上述步骤中未变性的总蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量检测试剂盒测蛋白浓度，蛋白浓度测定方法如下： ✦✦ 配制蛋白标准贮备液 取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）蛋白标准管中，将25 mg蛋白标准品完全溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。 ✦✦ 配制蛋白标准工作液 取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。 ✦✦ 绘制标准曲线（酶标仪法） 将蛋白标准工作液分别按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲线。 ✦✦ 准备待测样品 将待测的蛋白样品进行适当稀释（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。 ✦✦ 配制BCA显色工作液 将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。BCA显色工作液可室温保存，24 h内使用。每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。 ✦✦ 检测 向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL，充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30 s），37℃反应30 min后，以标准曲线0号做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。（注：也可以在室温反应2 h，或60℃反应30 min。如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应） ✦✦ 计算 以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。 1. BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大，吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化，如果不能精确控制显色反应的时间和温度，建议每次测定都需要做标准曲线。 2. 在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。 3. 为保证蛋白的精确定量，样品的提取和蛋白标准品的稀释配制最好选用相同的缓冲液，同保证两者检测条件一致。如果缓冲液本身就有较高的背景值，建议使用其他的方法测定。 4. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。 WB实验步骤  1 清洗玻璃板 用洗涤剂清洗垂直电泳仪玻璃板，清水冲洗两次，再用纯水漂洗一次，自然晾干或者使用风扇吹干； 2 配置分离胶和浓缩胶 根据目的蛋白分子量和所选电泳缓冲液不同，选择合适浓度的SDS-PAGE下层胶，参照表格如下：  配制10% AP溶液：称取AP（过硫酸铵）粉末0.1 g，用1 mL纯水完全溶解。该溶液4℃存贮1-2周有效，-20℃保存3个月有效； 根据实验需求，等比例混合对应的溶液A和B，加入适量的10% AP溶液，分别配制下层胶溶液、上层胶溶液。不同规格以及不同厚度的玻璃板可以等比例调整上层胶和下层胶溶液的配制体积，以常用规格约8.3 cm×7.3 cm 凝胶板和10% SDS-PAGE彩色(红色)凝胶超快速配制试剂盒为例，推荐配制体系如下表格：  配胶试剂里面的 AP 需要根据实验室实际温度来适量的增加或者减少，比如夏天温度较高，自然凝胶速度较快，AP 的量需要适当的减少；冬天温度低，凝胶慢，需要适量的增加。 3 制胶 向两块玻璃板中间胶室中缓慢注入配制好的下层胶溶液至胶室的三分之二到四分之三处（根据实际实验需求来定），然后使用双蒸馏水左右移动均匀加至胶室内，使其起到密封作用（加样时请务必小心，避免产生气泡）。静置15-30 min左右等待凝胶聚合，倒出双蒸馏水，并用吸水纸清理胶室残留液体。 使用配制的上层胶溶液加样灌满胶室（高度至凹板玻璃缺口上沿），随后插入加样梳子。等待约15-30 min凝胶完全聚合后，制胶过程完成。 4 上样电泳 等浓缩胶凝固好，拔掉梳子，如果点样孔弯曲，可用上样针拨正，之后可上样，Marker孔加入5-10μL蛋白Marker，其余蛋白总上样量30-50μg。将制胶器放进电泳槽，倒入电泳缓冲液，连接电泳电源，将电压调至 60-90V ；样品进入分离胶之后，将电压调至 120-150V，等到溴酚蓝指示剂距离胶最底部大约 1cm，即可终止电泳 （想要更快完成电泳实验，或对小分子蛋白分离要求更高。 1、注意保证上样体积尽量一致，否则可能导致蛋白条带不在同一水平线；如有空置的加样孔，需加等体积的1×loading buffer，以防相邻通道蛋白样品的扩散；上样时需缓慢加，切忌快速吹打以免引起蛋白样品溢出，此外，上样体积要小于上样孔的总体积。 2、电泳液一般要求内槽加满，外槽加到 1/4 即可。1.0mm 玻璃板最多点样 20μL，1.5mm最多可以点 40uL; 浓缩胶电压需要根据温度来选择，室温较高，电压低一些，室温较低，浓缩胶电压高一些（夏天一般建议浓缩胶电压 75V，冬天 90V,分离胶固定为 150V 高电压。具体调电压时间可以参考 marker，如果发现 marker 分开了，说明蛋白进入了分离胶。夏天温度比较高的时候需要将电泳槽放在冰水里面降温，防止温度过高使凝胶变形。 电泳相关常见问题和处理方法 “微笑”现象  条带出现微笑现象(中间凹两边翘起)：主要由于凝胶中间部分凝固不均。 处理方法：应待凝胶充分凝固后电泳，或者加入催化剂后充分混匀。 拖尾现象  条带出现拖尾现象：主要是样本溶解效果不佳，或分离胶浓度过大，或电泳缓冲液放置时间过长。 处理方法：加样前离心；加适量的样品促溶剂；降低凝胶浓度或使用梯度凝胶；重新配置电泳缓冲液。 条带过粗  条带过粗：可能是上样量过大；浓缩胶未浓缩好；浓缩胶pH值不正确；电压过高。 处理方法：减少上样量；增加浓缩胶长度；保证浓缩胶的pH正确（6.8）；降低电压。 纹理现象  条带出现纹理现象：可能是样本中不溶性颗粒引起的。 处理方法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 条带不整齐  条带不整齐： 可能是由于胶凝固不均匀，建议待胶完全凝固后上样； 可能是由于电泳的时候，有气泡在胶的下边缘，建议电泳前，检查并赶走胶底部的气泡； 可能是由于上样buffer不是工作液浓度，建议重新配置上样buffer； 可能是由于拔梳子导致样品孔不齐，建议水平缓慢的拔梳子。 |
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