  上海欣软《动物行为实验手册》正在免费包邮发放中，《动物行为实验指南》是前者的进阶篇，全书预计600页+，内容更加详实严谨，印书版预计11月份完成，获取方式请关注公众号：脑声常谈的后续通知。  前额叶皮层 (PFC) 是哺乳动物大脑的一个主要区域，已进化为执行高度复杂的行为功能。它在认知、情感、奖励和执行功能中发挥着重要作用。除了调节智力和情绪行为外，慢性疼痛还与PFC活性低下有关，经颅刺激 PFC可以缓解疼痛。那么，一个核心问题是 PFC如何组织和管理如此多样化的功能——从认知过程到自主疼痛调节？为了解决这个问题，该文章作者之前就进行了单细胞 RNA测序 (scRNA-seq) 来解码 PFC的细胞异质性，揭示了多种细胞类型。然而，这些研究缺乏有关不同细胞类型的空间组织和相互作用的信息，而这些是 PFC功能多样性的主要决定因素。PFC的功能区域专业化可能是由于多个层面的独特特征，包括分子组成（转录组）、环路组织（连接组）和每个皮质区域内细胞亚型的解剖（空间）组织。解码这种组织逻辑不仅对于皮质功能的机械理解至关重要，而且对于开发选择性针对皮质起源的神经系统疾病的药物至关重要。 在此背景下，2023年10月16日，美国哈佛医学院和波士顿儿童医院的张毅教授及Jeffrey Moffitt教授在Nature Neuroscience杂志上发表了题为“Spatial transcriptomics reveal distinct organization of mouse prefrontal cortex and neuronal subtypes regulating chronic pain”的文章，解码了 PFC 及其子区域的空间组织并揭示了受慢性疼痛影响最严重的 PFC 神经元簇的分子特征。
本文中作者采用多路抗错荧光原位杂交（MERFISH）的方法，对3只成年雄鼠的额叶皮层进行空间转录组分析。结果从这三个独立样本的额叶皮质区域获得了高度一致的50万个细胞。这些细胞主要包括兴奋性神经元，抑制性神经元和非神经元细胞三大类。这些主要细胞类型进一步分为以下 52 种分层组织的细胞亚型：18种兴奋性细胞亚型、19种抑制性细胞亚型和 15种非神经元细胞亚型。基于 MERFISH 坐标，作者还揭示了冠状切片的解剖布局和每个单个细胞的精确定位：分子相似的兴奋性神经元集中在一起形成不同的层，从中出现了大脑皮层特征的层状组织学；抑制性神经元和非神经元细胞分布广泛，不形成特定的层。
图1MERFISH 揭示了构成 PFC和相邻皮质的分子多样化细胞类型和亚型 与相邻皮质相比，前额叶皮层的功能和连接性非常独特。因此作者接下来探究这种功能和连接性差异是否与其特殊的细胞组成有关。通过统一流形逼近与投影（UMAP）发现兴奋性神经元和抑制性神经元在 PFC“内”“外”表现出明显的亚型选择性。此外，PFC的不同功能分区，例如背侧前扣带皮层（dACC或ACAd）、前边缘皮层（PL）、下边缘皮层（ILA）、背脚皮层（DPP）以及部分内侧眶额皮层（ORBm）中具有不同的细胞组成。这有助于解释 PFC 的亚区特定功能（某些亚区如何调节特定行为）及其对神经精神过程的生理和病理复杂性的影响。
图2 小鼠 PFC 中选择性富集不同的神经元亚型 大脑区域之间的功能差异通常是分子适应的基础，因此，作者进一步探究PFC的独特功能和细胞组织是否与特殊的分子特征相关。结果显示，MERFISH 文库中检测的大量基因在 PFC 和邻近皮质之间存在差异表达。使用iSpatial生物信息工具，分析揭示了190个PFC富集基因和182个PFC缺失基因。对这 372 个基因的信号通路富集分析显示，阿片类信号通路、内源性大麻素通路和谷氨酸受体信号通路是排名前三的通路。这表明 PFC 独特的分子组成确实与其特殊功能有关。
图3 PFC中表达富集或缺失的基因 众所周知，PFC 的兴奋性锥体神经元投射到不同的皮质下目标，包括纹状体、伏隔核（NAc）、丘脑、下丘脑、杏仁核、导水管周围灰质（PAG）或腹侧被盖区。然而，投射神经元的空间组织，以及不同的神经元亚型是否投射到不同的目标，尚未得到很好的表征。因此作者通过联合分析MERFISH和单细胞神经元投射数据，使用机器学习方法预测兴奋性神经亚型的下游投射脑区。预测模型的受试者工作特征（ROC）曲线以高置信度独立预测了六个不同的投影目标，包括对侧PFC（cPFC）、背侧纹状体（DS）、下丘脑、NAc、PAG和杏仁核。这一分析使得能够将投射到不同区域的每种神经元类型的不同子集与其在 PFC 内的位置相关联。
图4 PFC 投射到主要皮层下目标的空间和分子组织 慢性疼痛与 PFC的转录适应密切相关，然而这些变化的空间或细胞类型特异性分辨率尚不清楚。这里作者使用 MERFISH尝试识别受慢性疼痛影响的特定 PFC 神经元亚型。使用慢性神经性疼痛的备用神经损伤（SNI）模型，使小鼠出现慢性神经性疼痛状态。收集三对假手术小鼠和 SNI 小鼠的大脑用 MERFISH 进行表征，UMAP可视化和重叠，随后进行转录组细胞类型比较。结果表明 L5 ET 1 是受影响最严重的亚型，该神经元亚型专门投射到 PAG。活性标记结果显示投射到PAG的L5 ET 1亚型神经活性明显降低，这一发现具有特别的相关性。这些结果为未来通过使用基因工程动物模型进行有针对性的神经元活动操纵的功能研究留下了宝贵的前景。
图5 慢性疼痛引起 PFC 兴奋性神经元的细胞和分子变化 综上，这篇文章使用MERFISH（一种基于图像的空间分辨单细胞转录组学方法）解码了 PFC 及其子区域的空间组织。结果表明 PFC 的细胞组成与其相邻的皮质区域不同。PFC 采用独特的分子特征来适应其与其相邻皮质不同的特定电生理特性。并基于投影、转录和活性标记，揭示了受慢性疼痛影响最严重的 PFC 神经元簇的分子特征。这张综合图谱将有助于解码健康和疾病中特定 PFC 功能的离散分子、细胞和环路机制。  https:///10.1038/s41593-023-01455-9  特别鸣谢 |
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