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聚焦超声 （FUS） 与静脉注射微泡 （MB） 相结合，旨在通过血脑屏障 （BBB） 局部和非侵入性地输送治疗药物。该方法的安全性已在小鼠和非人灵长类动物中得到充分证实，目前正在进行临床试验。对FUS BBB开放的免疫治疗反应首先在递送方法的功效和安全性研究中发现，此后在从阿尔茨海默病到抑郁症的神经系统疾病中也被观察到。单独打开FUS BBB可以改善神经退行性病理学，同时增加神经发生并增强认知功能。这些效应与细胞因子、趋化因子、营养因子和其他与免疫功能相关的基因的表达同时发生。由于脑巨噬细胞在神经发生、突触可塑性和认知功能中的作用得到充分证明，它们已被假设在 FUS BBB 开放免疫治疗中发挥作用。脑巨噬细胞对FUS BBB开放反应的研究报告了治疗后巨噬细胞形态的变化，趋化因子和细胞因子表达增加，巨噬细胞与疾病病理学之间的相互作用增加。来自美国纽约哥伦比亚大学放射科和生物医学工程系的Elisa E. Konofagou教授长期致力于开发超声技术在肿瘤与中枢神经系统疾病中的应用，同时也是上述技术的开发者。但是FUS在打开BBB过程，并发挥治疗效果的生理活动变化并不清楚，尤其是免疫系统的响应，这些细胞对BBB完整性的维持至关重要。近日，该团队于Nature Biomedical
Engineering上发表了一项关于FUS打开BBB过程中中枢神经系统相关巨噬细胞（CAM）和小胶质细胞生理活动的工作。该项工作表明FUS BBB开放通过CAMs的募集和小胶质细胞的增殖以及通过疾病相关小胶质细胞（DAMs）的亚群数目增加来重塑免疫环境。小胶质细胞和CAM都显示出在治疗早期与晚期基因表达的迁移。疾病相关小胶质细胞的亚群数目也增加了，伴随着与胶质生成和吞噬作用相关的基因的上调。脑巨噬细胞的耗竭显著延长了血脑屏障开放的持续时间。为了阐明FUS
BBB开放对脑巨噬细胞的影响，对流式细胞术选择的脑巨噬细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。在治疗后1天和3天评估四种治疗模式：FUS MB联合治疗组，仅FUS组，仅MB组和对照组。通过预处理质量控制的细胞被标准化，然后在所有单细胞测序运行中整合。积分后，细胞被聚集并进行统一流形逼近与投影（UMAP）实现降维处理。低分辨率聚类产生了11个不同的聚类，确定了5种细胞类型：1个中性粒细胞簇、1 个单核细胞簇、1 个神经干细胞簇 （NSC）、7 个小胶质细胞簇和 2 个 CAM 簇。细胞类型特异性标记验证每个簇的细胞类型。正如预期的那样，三个小胶质细胞簇表现出稳态小胶质细胞基因如Cx3cr1的表达增加，而CAM簇表现出CAM标记物如H2-Aa的表达增加。图 scRNA-seq识别不同的小胶质细胞和CAM簇接小胶质细胞经计算鉴定、选择、归一化、重新整合并聚类为13个聚类。对照样本和假手术之间的聚类分布相似，但FUS BBB开放后1天和3天的细胞中权重不同。FUS
BBB打开后1天的细胞上调趋化因子和细胞因子，包括Ccl4和其他早期激活标志物，同时下调稳态小胶质细胞基因，包括Cx3cr1。FUS BBB开放后3天的小胶质细胞上调干扰素相关基因，如Ifi30，同时继续下调稳态小胶质细胞基因。每个时间点显著上调基因的功能注释表明治疗后 1 天募集增加，且具有更高的平均细胞期评分和更大比例的主动分裂细胞。为了验证FUS
BBB开放后增殖增加的假设，使用EDU标记复制中的细胞。FUS
BBB 开放后 1 天和 3 天脑巨噬细胞中的 EDU 表达以及 EDU 和 GFP 共定位增加。为了进一步评估FUS BBB开放对小胶质细胞的影响，对DAM簇进行分析。DAM已被证明可以通过增加吞噬作用来限制神经变性。对每个簇与其他簇进行差异基因表达分析，并将簇2确定为DAM。绘制每次测序运行中治疗组的 DAM 小胶质细胞的百分比，FUS
BBB 开放后 DAM 的百分比增加。此外，治疗组DAM的基因表达在时间维度上存在差异。在早期反应中，DAM上调趋化因子和细胞因子编码基因，如Ccl4，在晚期反应中，DAM上调干扰素编码基因，包括Ifitm3。对两个时间点DAM内显著上调的基因进行功能注释表明，在FUS与MB联合治疗后，DAM的胶质生成，吞噬作用和迁移能力有所上调。迁移性 CAM 在治疗后 3 天浸润并表现出炎症特征：虽然小胶质细胞是大脑中的主要免疫细胞类型，但在稳态大脑中存在少量常驻 CAM。为了响应大脑病生理变化，驻留在血管周围区域和脑膜边界的CAM在募集后通过常驻免疫细胞信号传导浸润大脑。重新整合和聚类揭示了三个不同的CAM簇H2-Ab1+，Mrc1+ 和Ccl2+。三个簇可能是由于细胞的独特起源，H2-Ab1+簇进一步由H2-Aa1+ 和Cd74+的上调定义，已被证明起源于硬脑膜和脉络丛。同样，通过 Lyve1+ 和Prps1+ 上调进一步定义的Mrc2+ 簇与硬膜下脑膜起源一致。这与Ccl2+ 形成鲜明对比，Cc44+ 的定义是参与迁移的基因的过表达。Ccl2+ 簇的起源从文献中尚不清楚，但治疗后Mrc1+ 簇的代表性组成比例下降表明它可能是来自Mrc1+ 簇的细胞的炎症表型。CAM的簇分布在FUS BBB开放处理后1天和3天发生偏移。治疗条件之间的差异基因表达表明，在FUS BBB开放后1天，CAMs上调趋化因子和编码基因（如Ccl3和Ccl4）的细胞因子，类似于小胶质细胞早期反应特征。治疗三天后，跨簇的CAM上调激活相关和免疫相关干扰素基因，如Ifitm3，也类似于小胶质细胞特征。时间特征的功能注释表明治疗后1天迁移增加，两个时间点的免疫和防御反应增加。与其他三种情况相比，FUS BBB开放治疗后3天CAM占全脑巨噬细胞的百分比增加了10倍，但不会触发增殖。综上所述，这些数据表明，常驻CAM在治疗后1天采用早期反应特征，将细胞招募到该区域，并且常驻和迁移的CAM在治疗后3天表现出延迟反应特征，促进免疫和防御反应。图 FUS BBB开放治疗促进中枢神经系统相关的巨噬细胞向该区域的迁移并表现出炎症特征为了验证小胶质细胞增殖和CAM浸润的效果，使用流式细胞术来量化治疗后的脑巨噬细胞亚群大小。CD45（CAM的标志物）和CD9（DAM的标志物）的中位荧光强度（MFI）在治疗后1天对治疗的反应显着增加，并且在治疗后3天呈增加趋势。有趣的是，CD45 MFI似乎在治疗后1天达到峰值，而我们的测序数据显示CAM浸润的峰值为治疗后3天。这是可能是CD45对CAM的非特异性，并且可能包括在处理后1天主导样品的其他外周细胞的浸润。这些结果呼应了测序结果，发现吞噬性小胶质细胞的百分比在治疗后1天和3天都增加了。为了了解小胶质细胞对FUS BBB开放反应在FUS BBB开放恢复中的作用，利用PLX3397（研究饮食）进行了一组实验，PLX3397会消耗高达99%的脑巨噬细胞。根据处理前的饮食和整个BBB恢复分析，分为耗竭和对照队列。与第0天相比，治疗后1天和3天的开放体积在耗竭队列（紫色）中明显大于对照组（灰色）。事实上，在第1天，来自耗竭队列的小鼠与第0天的开放体积相似甚至增加，但对照组小鼠的平均开放体积约为第0天的50%。有趣的是，第0天的FUS BBB开口体积在耗竭动物和对照动物之间没有显着差异。正如假设的那样，与对照动物相比，耗尽动物的BBB开放持续时间明显更长。这些结果表明，脑巨噬细胞协助控制BBB开放体积的水平，并且脑巨噬细胞对FUS BBB开放的反应加速了BBB恢复的时间线，但脑巨噬细胞对BBB恢复并不是必要条件。FUS BBB开放治疗已显示出希望，不仅作为一种跨BBB的药物递送方法，而且作为一种有效的免疫治疗方法，以改善疾病病理学和恢复神经系统疾病的行为缺陷。基于先前的报道，将脑巨噬细胞与免疫治疗机制联系起来，作者团队在FUS BBB开放治疗后的第1天和第3天对脑巨噬细胞进行了单细胞测序，对分离小胶质细胞和CAM进行独立分析。差异基因分析表明，脑-巨噬细胞对治疗的反应是一个时间过程，CAM 和小胶质细胞在治疗后 1 天均表现出早期反应特征，其特征是趋化因子和细胞因子表达增加，表明细胞募集。治疗后 3 天的晚期反应的特征是 CAM 群体大小增加和干扰素相关基因上调，表明两个脑巨噬细胞群体的细胞活化和免疫反应。细胞周期分析以及免疫组织化学验证证实了小胶质细胞在两个时间点上的增殖增加，这是CAM没有表现出的。DAM是一个已被证明限制神经退行性疾病发展的亚群。响应FUS BBB开放，DAM群体大小增加，细胞上调与吞噬作用和胶质发生相关的基因。利用PLX3397来消耗小胶质细胞，发现耗竭队列中的动物具有明显更长的BBB开放持续时间。BBB在没有脑巨噬细胞反应的动物中也会恢复但是更慢。这些结果表明，脑巨噬细胞对FUS BBB开放的反应加速了BBB恢复，但对于BBB恢复不是必需的。未来的工作将评估脑巨噬细胞耗竭对FUS BBB开放免疫治疗效果的影响，包括量化由此产生的行为和病理负荷。小胶质细胞和CAM起源于相同的前体细胞，但小胶质细胞的寿命要长得多，其随着年龄的增长逐渐变得功能障碍和吞噬力降低，因此，在神经变性的情况下，它们可能成为神经退行性疾病治疗的关键靶标。FUS BBB开放通过小胶质细胞增殖，CAM募集和DAM种群规模的增加重塑免疫环境。这三种关键反应都单独与神经系统疾病的改善有关，并且该组合被认为是FUS BBB开放免疫疗法的机制。未来的工作将研究FUS BBB开放后触发DAM反应的特定神经变性相关分子模式，CAM浸润持续时间和脑巨噬细胞反应持续时间。这项研究有两个关键的局限性，将在未来的研究中解决。首先，这项研究是在年轻的野生型小鼠中进行的，而不是在病理或衰老模型中进行的。由于脑巨噬细胞随着疾病和年龄而变化，因此它们在衰老或病理模型中的反应可能与健康野生型动物的反应不同。其次，在每只动物的整个海马体上获得细胞，使得与BBB开放面积相比，不可能在空间上定位表型的变化。未来的研究将通过在患病和老年动物中实施类似的研究和评估单侧治疗动物同侧和对侧区域内大脑区域的脑巨噬细胞反应，并利用空间测序来定位参考BBB开放的表型变化来解决这些局限性。Alina R Kline-Schoder,
Sana Chintamen, Moshe J Willner, et al. Characterization of the responses of
brain macrophages to focused ultrasound-mediated blood-brain barrier opening.
Nat Biomed Eng. 2023 Oct 19.https://www./articles/s41551-023-01107-0
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