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开学了，要做实验啦！组会上确定好的课题是RNAi，经过一轮激烈的讨论，综合多个产品比对后（RNAi产品选择见吉玛微信软文：小白讲产品），决定使用siRNA来做实验。决定了就要行动，火速订购，还没有反应过来呢，订购的siRNA就拿到了。然后呢？然后应该怎么办？然后当然是看siRNA使用备忘录啦，一文在手，siRNA实验无忧！ 一、siRNA产品说明 目的siRNA：干扰目的基因的siRNA， 命名是基因名-物种-序列编号，比如P53-homo-282, 表示干扰的是人的P53的一个靶序列，siRNA位于基因的282位点 （由于基因信息更新或者转录本不同，对应的数值和实际位点可能有一定差异）。 NC：是通用的一段无义序列，也是众多文献使用的对照序列，和哺乳动物都没有同源性，适用于大鼠、小鼠、人等不同基因的研究。不同siRNA赠送的NC都是一样的，NC是可以通用的哦。 DEPC水：经过DEPC处理且高温高压去DEPC后的无菌无酶水，用来溶解RNA oligo，防止RNA快速降解。 阳性对照GAPDH：阳性对照是针对管家基因GAPDH的有确定干扰效果的siRNA，是检测操作步骤的——如果操作没有问题，细胞转染效率较佳，加了阳性对照siRNA后，这个管家基因GAPDH的量一般会敲低70%以上（干扰GAPDH的内参可以选择用β-actin）。 注意：阳性对照干扰GAPDH，siRNA干扰目的基因，干扰GAPDH和目的基因是平行实验，分析目的基因干扰效率的时候，不要把阳性对照干扰GAPDH这组实验数据计算进去。 FAM-NC：这个是带荧光的NC片段，用来确定转染效率，摸索转染条件——用不同的条件（根据转染试剂说明书给定用量的0.5-3倍）转染FAM-NC后，换液后观察细胞内是否有荧光，来判断siRNA有没有转染到细胞中，方便确定最佳转染条件。优化好条件后，再用相同的条件来转染目的siRNA，可以基本确定目的RNA转进了细胞。 二、保存 吉玛提供的RNA oligo是干粉的，干粉比较稳定，可以常温运输。收到RNA oligo后，直接把干粉-20冻存，需要使用时再拿出来溶解。 注意：收到后不要先行溶解，干粉比溶液稳定，溶解后更容易降解。 三、溶解 1、拿出需要的siRNA准备溶解 注意使用哪个siRNA，溶解哪个，不要全部溶解。如订购的siRNA套餐，需要先用FAM-NC摸索转染条件，就只溶解FAM-NC，其他的siRNA还是干粉冻存。等FAM-NC摸索好转染条件后，需要做目的siRNA转染时，再溶解目的siRNA，根据FAM-NC摸索的最佳用量来进行分装（比如说摸索的用量是10μl，就12μl分装一管），分装后冻存。 2、离心 siRNA是干粉形式，通常是透明的，看不到（siRNA量大的话可以看到）。运输过程中干粉有可能飞到管壁、管盖上，所以溶解前先离心把RNA干粉离心到管底，转速可以3000-10000rpm，离心时间是5-2分钟（转速低就多离心几分钟，转速高就少离心几分钟，只要把干粉离心到管底就可以）。 3、加DEPC水溶解 对于21个碱基左右的双链siRNA/miRNA，1OD大约是2.5nmol，加125μl的DEPC水，得到20μM的浓度；对于21个碱基左右的单链RNA（inhibitor），1OD的大约是5nmol，需加250μl的DEPC水，得到20μM的浓度（如果是0.5 OD或者2OD分装，加入水量就减半或者加倍）。可以枪头反复吹打溶解混匀，也可以低速涡旋震荡溶解。 注意：siRNA一般是用pmol来计算用量，如果按μg计算，1OD=33μg左右，如果加125μl水溶解后，浓度是264ng/μl左右。 4、溶解后分装，不要反复冻融 由于RNA容易降解，溶解使用DEPC水，溶解使用的管子、枪头也都要无酶无菌处理，以防止RNA oligo降解; 如果是荧光标记的RNA oligo，还需要用锡箔纸包一下防止淬灭；分装后3个月内用完（时间越久，降解越严重，可能会导致实验重复性不好）。 四、细胞转染 1、转染具体使用剂量 siRNA一般工作浓度是30-150nM。具体用量要根据转染试剂说明书来确定。如果使用GP-transfect-Mate转染试剂，在如下表格范围内进行优化，比如24孔板，可以设置siRNA（pmol） mate的梯度：20pmol 1μl；40pmol 2μl；60pmol 3μl；80pmol 4μl等。 如果使用其他转染试剂，可以在转染试剂说明书给定用量的0.5-3倍摸索条件；  *计算依据：20μM的浓度情况下，1μl含有20pmol，在1ml细胞培养液中加1μl（20pmol），那终浓度就是20pmol/ml=20nM。加2μl就是40nM，以此类推。 2、转染操作流程  转染注意事项： 实验中需要注意细胞状态要好，代数不要大，细胞密度适中，50%左右（根据细胞生长情况调节），铺板时要铺均匀（可以先用培养液润湿培养皿表面，这样加入细胞后容易分散），添加转染复合物时要小心均匀滴加。如果细胞生长过快，建议用5%血清进行培养。 使用GP-transfect-mate 转染试剂转染时细胞培养基中是否可以含有血清： （1）配置siRNA和转染试剂的时候一定要用无血清无双抗的培养基； （2）配置好复合体后滴加到细胞中的时候，可以：①细胞皿内培养基使用无血清无双抗培养基，转染后6小时左右换液；②细胞皿内培养基用含血清培养基，转染后24小时换液（这个方法转染效率更好一些）。 注意：转染时最好去双抗，双抗转染时对细胞有毒性，会导致细胞的死亡或者状态不好。 五、siRNA无效原因解析 1、转染效率问题：如果少量siRNA进入细胞，作用于基因后，有时候细胞会有补偿机制，表达量反而升高。建议先用FAM-NC来确定一下转染效率。找到一个最佳（大于70%）的转染条件，就用这个条件来做目的siRNA干扰实验。FAM-NC转染后6-24小时间观察一下，转染进去的整个细胞是绿的，没有转染进去的是一些绿色的小点（FAM-NC和转染试剂形成的复合体颗粒）粘附在细胞上，发的光是点状的。  2、检测时间点：建议转染后24-48小时检测基因水平变化，48-72小时检测蛋白水平变化。不同基因的半衰期不同，siRNA干扰是抛物线形的，多做几个时间点有利于siRNA干扰效果的测定。 3、引物位置：我们推荐RT-PCR的引物设计在target位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割，切割导致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。 4、RNA降解：收到后-20℃保存，溶解后要最小量分装，建议-80℃保存，3个月内用完，避免反复冻融或者4℃保存。干粉保存最长不要超过6个月，使用的管子、枪头要无酶处理。 5、干扰靶点不合适：建议更换其他siRNA位点。如果您订购的是我们siRNA套餐，在转染效率达到70%以上时，或者阳性对照干扰效率达到70%，目的基因没有达到既定干扰效果，提供相关结果过来，我们再免费重新设计合成一次哦。 6、基因问题：如果基因表达量非常低，或者功能比较特殊，要受到比较严格的细胞调控，或者是核内lncRNA，这样siRNA也不容易干扰。可以考虑采用CRISPR基因编辑或ASO反义技术进行研究。 |
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