【原】PC12细胞培养方法步骤

PC12细胞培养方法步骤

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具神经内分泌细胞的一般特征，因其具可传代特点，广泛应用于神经生理和神经药理学研究。

1. PC12细胞有两种：未分化型和分化型。其中未分化型的PC12细胞贴壁能力强，传代时需要胰酶消化，形状不规则。分化型PC12细胞传代时不需要胰酶，直接可以吹下来，形状规则。未分化型的PC12细胞对药物的敏感性较之分化型的要差一些。

2. 由于PC12细胞是一种肿瘤细胞，在传代次数较多后，它的形状和性状会发生改变。这些改变尤见于未分化型PC12细胞。主要是细胞形状变得更加不规则，对药物的敏感性愈加下降。因此，建议长期用PC12细胞作实验需要严格控制细胞的传代次数。

3. 在复苏细胞时动作一定要迅速，放入37℃水浴，一边震荡一边融化，约1～2min融化后马上加入培养液中，培养12～24小时后更换一次培养液，这样可以去除DMSO和死亡破碎的细胞。细胞每天观察一次即可，经常挪动会影响细胞生长（需要注意过滤除菌后培养基的pH值，一般过滤后pH值会有所改变，可以配制过滤除菌的1 M HCl或NaOH用于培养基pH调节）。复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞，去除了冻存液中的DMSO，如果没有去除DMSO，细胞培养过夜后就要彻底换液；如果复苏时洗涤离心过，可以待传代时再换液也可（根据经验，复苏时去除DMSO，细胞的生长状态更好一些）。

4. 状态良好的细胞复苏后 4 h即可贴壁，开始增殖，大约2 d即可传代，接种48h应该到了对数增长期。

5. 每天观察一两次细胞不会对细胞的生长造成不良影响，但每次观察时间不宜过长，要严格控制。

6. 传代时最好不用胰蛋白酶，因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。有人做过对比，用胰蛋白酶消化传代PC12, 传代后的细胞虽然贴壁，形态也好，但增殖缓慢，所以可尝试采用无菌小巴氏管吸取培养液直接吹打，传代后细胞增殖迅速（可用5%FBS）

7. 传代的时机最好选在细胞生长旺盛，占瓶底70%－80%时最好，如果细胞长的太满，细胞的状态会越来越差，最后大片死亡；这种细胞传代后生长也不好；而且长的太满后，细胞贴壁牢，难于吹起来，相反，70%－80%时细胞很容易吹起来。

8. 如果细胞贴壁太紧，不得不用胰蛋白酶消化，注意低浓度，短时间，多洗涤。一般用0.025％的胰蛋白酶，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，或用肉眼观察，瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止，中止一定要彻底，用含血清的培养液多洗涤离心几次，确保去除剩余的胰蛋白酶，否则传代后的细胞生长缓慢。

9. 就培养器皿的选用，推荐60mm的培养皿中培养传代，优点有二：第一，在皿里细胞生长的更快，原因可能是皿比瓶的气体交换更好；第二，传代时吹打更方便，不易污染。

PC12健康与否的判断方法（生命科学战友总结）：

没有加NGF时，如果细胞很健康，会长出很短的小轴突，整体圆圆的，很可爱。当它不健康时，你会发现：1.细胞不易贴壁了，会漂很多；2.细胞会呈现椭圆形，轴突变长（这时的细胞其实状态已经不好了，即使贴壁也不行！）见下图。

         

附.关于做PC12细胞的MTT时遇到的问题(收集自丁香园)

丁香园omician的问题：

PC12在已用0.1 mg/mL poly-L-Lysine包被的96孔板中经NGF处理分化后2-3天后，吸弃培养液，加PBS洗涤（用于做后续处理），总会致使细胞大量丢失，尤其是孔中央那块。不知有没有什么好方法能解决这个问题。（注：未分化细胞吸弃培养基没有这个问题）。

另外，大家在用最近一批Hyclone Equine serum（马血清）时PC12的培养有没有聚团漂浮的问题。我最近换了四次不同公司代理的Hyclone马血清（均是在Aug/2008~Mar/2009左右到期），无论灭活还是不灭活PC12总出现这个问题。而用我以前仅剩的一瓶Aug/2008到期的马血清细胞却生长良好。现在这瓶也快用完了，而订Gibco的要一个月，真不知该怎么办了。（PC12一直是以Hyclone 1640+10%Hyclone equine serum+5%Hyclone fetal bovine serum培养的）

丁香园dabao的观点：

PC12细胞我以前经常做相关试验。你所述现象我以前也有碰到过，后来注意以下几点，或许有可能改善。

（1）PBS可能过冷。分化后PC12细胞生长一段时间后贴壁能力有些会减弱，尤其板中间生长密集处或者培养时间稍长。此时，若用刚从冰箱中取出的PBS冲洗，很可能造成细胞脱落。

（2）PBS冲洗时一定不能用枪向孔中央直接大力吹打，很容易造成细胞被吹掉。

结合以往经验，建议：

（1）PBS自冰箱取出后置室温20～30min，然后使用。

（2）用滴管或枪头沿孔壁慢慢加入PBS。

（3）也可以尝试用预热无血清培养基进行冲洗。

丁香园syschenxiang的问题：

我正在做PC12 的MTT。在MTT的最后两步。即加完MTT四小时后，要将培养液吸出，然后加DMSO。但是PC12贴壁不严，吸出培养液时，很容易将其吸出。本人小心再小心还是不可避免。还有，也试过轻轻翻转过来，可是底部的细胞明显的随着液体的流动而流动，用劲小也无济于事。

丁香园Xray的观点：

有些离心机可以离心96空板，离心后细胞应该就不会容易被吸出了

附.PC12的检测指标(收集自丁香园)

丁香园淡蓝色的鱼的问题：

PC12细胞模拟的神经细胞损伤检测时，除了MTT法，还有其他指标吗

丁香园zengtony的观点：

可以检测神经保护相关的一系列指标，如ＬＤＨ（乳酸脱氢酶）的漏出率，过氧化损伤系列指标（ＳＯＤ，ＭＤＡ，活性氧等），游离钙浓度，细胞凋亡，神经递质的释放（如多巴胺等），关键是看你所用的干预因素的性质。

如何使PC12细胞贴壁更牢

丁香园ivy_mayan的问题：

在做PC12的H2O2损伤模型时，由于细胞经过H2O2的冲击，大多活性不好了，所以贴壁性变差，结果在测MTT时由于要去掉上清液，细胞会被一同吸走，这样所测吸光值就不准了，请问大家，怎么可以使PC12贴壁更牢（即使经过损伤冲击）？

丁香园george的观点：

1.细胞培养板的选择：一定要用进口的培养板，国产的大多贴不好。

2.尽量使细胞处于良好的状态，包括培养液要新鲜配制备，注意PH值，提高牛血清的浓度。

丁香园midas的观点：

1.用PLL或鼠尾胶包被扳子！

2.H2O2浓度越大，作用的时间应该越短。

3.MTT时，不必要完全吸去上清液（当然每个孔吸出的量应该一样多），尽量不要洗掉细胞。

丁香园drcici的观点：

细胞的贴附状态涉及很多方面，细胞的类型，细胞本身的状态，培养条件以及培养板等因素都可以影响细胞的贴附。

除了以上高手的经验外，我想还要注意PC12的密度，一般良好状态的PC12生长迅速，可以在2~3天就可以长满一个中皿，如果你用96孔板的话，长满的时间应该更短。但是长得过满的细胞状态并不好，容易脱落，不知你的PC12是以何种密度接种的，什么时间加双氧水？最好是在PC12长至70-80%时加双氧水。

还有加入的双氧水的温度，也要与培养温度相同，去除双氧水后，要用培养液把细胞洗2-3遍。

丁香园ivy_mayan的问题：

具体我是这样操作的：96孔板

以2x10的五次方密度接种细胞，24小时后加入不同浓度的h2o2（50-500UM）, 作用不同时间后(0-8h)加入MTT,孵育4h后去上清，加入DMSO溶解结晶,测490nm下的吸光值。

我有以下疑问：

1）板我已经过poly-l-lys处理过，但是细胞贴壁还是不好,如何解决？

2)加入MTT前是否要把培养液去掉, 并用PBS洗两遍以彻底去除H2O2及血清的影响，只是这样一来细胞会丢失很多,该如何解决？

丁香园midas的观点：

1.增加PLL的浓度，50－100ug/mg

2.没有必要把培养液去掉，并用PBS洗！H2O2及血清对MTT的影响好像 还没有见到相关报道。

丁香园liandchu的问题：

我培养的细胞是pc12细胞,这种细胞不好贴壁,我用多聚赖氨酸包被,但我不知道多大分子量多聚赖氨酸及浓度去包被效果好?,

丁香园luopeng的观点：

用赖氨酸包被培养板和培养瓶时，应该选用多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万) ，我们用的是sigma P7890,效果还不错。

丁香园sweet的问题：

我打算养pc-12 ，听说这个细胞很难伺候，请教培养方法。何种培养基好?NGF的种类有讲究吗？

丁香园lrmoon的观点：

PC12细胞我养过，谈一谈体会，希望对您有帮助。

总体上PC12细胞不难养，不要有畏惧思想。

1.Medium：DMEM加2.5%FBS, 15%horse serum(都用Gibco的)

2.复苏后首次分皿时经消化后尽量用tip头柔和吹打15次，使成单细胞。

3.诱导可在经poly-l-lysine coating的24孔板中进行，细胞的种植密度不可太高，1×10E5即可。一般情况下经NGF50ng/ml一周就可见很明显的诱导特征（突起伸长，胞体变小，增殖减缓）

4.包被非常重要。PLL要质量好，不要多次回收使用，一般使用两次就丢弃。包被过夜后要彻底用灭菌ddH2O洗3遍。

5.实验尽量使用同一批号的试剂，以免细胞的表型发生变化影响实验结果。

6.NGF的质量也很关键，建议用sigma的。

PC12细胞图片展示（源自丁香园）

1.细胞种类：大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞

2.培养的天数：传代后2d

3.放大倍速：倒置显微镜 放大倍数：X100

4.培养基种类：RPMI1640培养基+10%胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长，呈卵圆形或多边形,细胞界限清楚，核分裂相明显，有伪足伸出，有的伪足较长,甚至连接在一起,细胞基本不透光,倾向于呈小簇状生长 。

             

丁香园jackyhoi99：

           

      

                            

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