【原】常规免疫组化及荧光免疫组化protocol(5/6)

一、常规免疫组化（以ChAT抗体为例）

  将制作的脑切片（本公众号《小鼠脑常规病理学检测（石蜡切片HE染色protocol）》）进行ChAT免疫组化染色

1)脱蜡和复水：二甲苯（Ⅰ）12 min→二甲苯（Ⅱ）12 min→100%乙醇（Ⅰ）3 min→100%乙醇（Ⅱ）3 min→95%乙醇3 min→90%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→蒸馏水8 min；

2)灭活内源性过氧化氢酶：切片滴加新鲜配制0.3% H₂O₂，室温10 min，然后PBS冲洗3次，每次5 min；

3)细胞打孔：切片滴加0.1% TritonX-100 室温孵育10 min，然后PBS冲洗3次，每次5 min；

4)热修复抗原：将切片浸入0.01 M枸橼酸盐缓冲液（PH=6.0），电炉加热至沸腾，断电冷却5 ~ 10 min后再次加热至沸腾，如此反复2次。最后PBS浸洗3次，每次5 min；

5)封闭：切片滴加5%正常山羊血清封闭，并在37 ℃湿盒中孵育20 min；

6)吸去封闭液，勿洗；

7)滴加配好的ChAT抗体（1：60稀释）工作液25 µl，4 ℃反应过夜后于次日晨37 ℃湿盒孵育1 h；

8)PBS洗3次，每次5 min；

9)滴加配好的生物素标记的第二抗体工作液25 µl，于37 ℃湿盒孵育30 min；

10)PBS洗3次，每次5 min；

11)每片滴加SABC试剂25 µl于37 ℃湿盒温育30 min；

12)PBS洗3次，每次5 min；

13)DAB显色：滴加配好的DAB显色液25 µl滴加在切片上，室温显色，显微镜下观测颜色深浅控制反应时间，待染色结束后用蒸馏水冲洗终止反应，然后PBS冲洗3次，每次5 min；

14)苏木精轻度复染1 min，自来水冲洗返蓝；

15)脱水透明：70%乙醇3 min→80%乙醇3 min→90%乙醇3 min→95%乙醇3 min→100%乙醇（Ⅰ）3 min→100%乙醇（Ⅱ）3 min→二甲苯（Ⅰ）4 min→二甲苯（Ⅱ）4 min→中性树胶封片→镜验。

16)以PBS置换一抗作为阴性对照，实验中每批切片做一张阴性对照。

二、荧光免疫组化（以Tau蛋白抗体为例）

  将制作的脑切片（本公众号《小鼠脑常规病理学检测（石蜡切片HE染色protocol）》）进行tau蛋白免疫荧光：

1)脱蜡和复水：二甲苯（Ⅰ）12 min→二甲苯（Ⅱ）12 min→100%乙醇（Ⅰ）3 min→100%乙醇（Ⅱ）3 min→95%乙醇3 min→90%乙醇3 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→蒸馏水8 min；

2)灭活内源性过氧化氢酶：切片滴加新鲜配制0.3% H₂O₂，室温10 min，然后PBS冲洗3次，每次5 min；

3)细胞打孔：切片滴加0.1% TritonX-100 室温孵育10 min，然后PBS冲洗3次，每次5 min；

4)热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH=6.0），电炉加热至沸腾，断电冷却5 ~ 10 min后再次加热至沸腾，如此反复2次。最后PBS浸洗3次，每次5 min；

5)封闭：切片滴加5%正常山羊血清封闭，并在37 ℃湿盒中孵育20 min；

6)吸去封闭液，勿洗；

7)滴加配好的tau蛋白抗体（1：60稀释）工作液25 µl，4 ℃反应过夜后于次日晨37 ℃湿盒孵育1 h；

8)PBS洗3次，每次5 min；

9)滴加配好的FITC标记的第二抗体工作液25 µl，于37 ℃湿盒孵育30 min；

10)PBS洗3次，每次5 min；

11)10%甘油封片→荧光显微镜下观察并拍照；

12)以PBS置换一抗作为阴性对照，实验中每批切片做一张阴性对照。

(图片来源于安徽大学硕士论文)