【原】PC12细胞活力及凋亡检测方法（MTT、流式、细胞爬片HE、免疫组化protocol）

一、 试剂配制

1)培养基：DMEM/F12培养基，加入10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素；

2)MTT溶液：称取50 mgMTT溶于10 ml PBS并过滤灭菌，避光保存；

3)0.25%胰酶：称取0.25 g胰酶，溶于100 ml PBS并过滤灭菌，4度冰箱保存；

4)PBS缓冲液：称取氯化钠9 g，磷酸氢二钠6 g，磷酸二氢钠0.4 g，蒸馏水溶解后定容至1000 ml，PH=7.4；

5)4%多聚甲醛：取多聚甲醛4 g，PBS缓冲液溶解，并定容至100 ml；

6)重铬酸钾酸洗液：称取50 g重铬酸钾粉末，溶解在100 ml蒸馏水中，少量多次加入浓硫酸（98%）900 ml并不断搅拌。

二、 PC12细胞培养

    PC12细胞株用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM/F12培养基在玻璃培养瓶中培养， CO₂细胞培养箱的培养条件为37 ℃，5% CO₂浓度，饱和湿度，待细胞长至80%丰度后用0.25%的胰酶消化传代l次（约2 ~ 3 d），倒置显微镜观察细胞生长状况，实验时取对数生长期细胞进行实验。

  进行MTT实验前将细胞接种到96孔培养板用无血清培养基培养；流式细胞仪检测前将细胞接种至6孔培养板用无血清培养及培养；免疫组化实验均用24孔培养板爬片法培养细胞，培养基为无血清培养基。

三、 MTT检测各组细胞活力

  取对数生长期的细胞，胰酶消化后以1×10⁵个/毫升的细胞密度，每孔100 μl接种于96孔板中无血清培养24 h，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl继续在CO₂细胞培养箱中孵育4 h，然后取出96孔培养板，弃去上清液，每孔加入150 μl的DMSO，放在摇床上振荡10 min，待紫色结晶完全溶解后用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的吸光值。以只加培养液的孔为调零参照，细胞活力用百分比表达，视对照组的细胞活性为100%。

  结果计算：细胞存活率=(实验组OD值一空白对照组OD值)/(对照组OD值一空白对照组OD值)×100%

四、 流式细胞仪检测凋亡率

  取对数生长期的细胞，胰酶消化后以1×10⁵个/毫升的细胞密度，每孔2ml接种于6孔板中无血清培养24 h，胰酶消化离心收集各组细胞，并用PBS洗涤两次（离心2000 rpm，5 min），然后用细胞凋亡检测试剂盒内的缓冲液300 μl重悬，加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，加入5 μl PI 混匀室温避光反应10 min，最后在1 h内进行流式细胞仪上机检测细胞凋亡的情况。

  在流式细胞仪的散点图上，左下象限表示为活细胞(AnnexinV-/PI-)，右下象限表示为早期凋亡细胞(AimexinV+/PI-)，右上象限表示为晚期凋亡细胞(AnnexinV+/PI+)，左上象限表示为坏死细胞(AnnexinV-/PI+)。

五、 HE观察细胞病理学改变

  取对数生长期的细胞，胰酶消化后以1×10⁵个/毫升的细胞密度，每孔500 μl接种于铺有小盖玻片的24孔板中无血清培养24 h，弃去培养液，每孔加入200 μl的4%多聚甲醛固定30 min，然后用PBS浸洗3次，每次5 min，小心取出盖玻片进行HE染色，步骤如下：

1)苏木精室温染色1 min→自来水浸洗返蓝8 min→蒸馏水冲洗3min；

2)切片脱水透明：70%乙醇3 min→80%乙醇3 min→90%乙醇3 min→1%伊红染色3 min→95%乙醇3 min→100%乙醇（Ⅰ）3 min→100%乙醇（Ⅱ）3 min→二甲苯（Ⅰ）4 min→二甲苯（Ⅱ）4 min→中性树胶封片→镜验。

六、 Bcl-2免疫组化

  取对数生长期的细胞，胰酶消化后以1×10⁵个/毫升的细胞密度，每孔500 μl接种于铺有小盖玻片的24孔板中无血清培养24 h，弃去培养液，每孔加入200 μl的4%多聚甲醛固定30 min，然后用PBS浸洗3次，每次5 min，小心取出盖玻片进行光镜免疫组化染色，步骤如下：

1)封闭：切片滴加5%正常山羊血清封闭，并在37 ℃湿盒中孵育20 min；

2)小心吸去封闭液，勿洗；

3)滴加配好的Bcl-2抗体（1：60稀释）工作液25 µl，4 ℃反应过夜后于次日晨37 ℃湿盒孵育1 h；

4)PBS洗3次，每次5 min；

5)滴加配好的生物素标记的第二抗体工作液25 µl，于37 ℃湿盒孵育30 min；

6)PBS洗3次，每次5 min；

7)每片滴加SABC试剂25 µl于37 ℃湿盒温育30 min；

8)PBS洗3次，每次5 min；

9)DAB显色：滴加配好的DAB显色液25 µl滴加在切片上，室温显色，显微镜下观测颜色深浅控制反应时间，待染色结束后用蒸馏水冲洗终止反应，然后PBS冲洗3次，每次5 min；

10)苏木精复染10 min，自来水冲洗返蓝；

11)脱水透明：70%乙醇3 min→80%乙醇3 min→90%乙醇3 min→95%乙醇3 min→100%乙醇（Ⅰ）3 min→100%乙醇（Ⅱ）3 min→二甲苯（Ⅰ）4 min→二甲苯（Ⅱ）4 min→中性树胶封片→镜验。

12)以PBS置换一抗作为阴性对照，实验中每批细胞片做一张阴性对照。

七、 Cyt-c和Bax表达的免疫荧光检测

  取对数生长期的细胞，胰酶消化后以1×10⁵个/毫升的细胞密度，每孔500 μl接种于铺有小盖玻片的24孔板中无血清培养24 h，弃去培养液，每孔加入200 μl的4%多聚甲醛固定30 min，然后用PBS浸洗3次，每次5 min，小心取出盖玻片进行免疫荧光，步骤如下：

1)封闭：切片滴加5%正常山羊血清封闭，并在37 ℃湿盒中孵育20 min；

2)小心吸去封闭液，勿洗；

3)滴加配好的Cyt-c或Bax一抗（1：60稀释）工作液25 µl，4 ℃反应过夜后于次日晨37 ℃湿盒孵育1 h；

4)PBS洗3次，每次5 min；

5)滴加FITC 标记的荧光二抗工作液25 µl，于37 ℃湿盒孵育30 min；

6)PBS洗3次，每次5 min；

7)每片滴加25 µl DAPI，室温下10 min；

8)PBS洗3次，每次5 min；

9)10%甘油封片；

10)荧光显微镜下观察并拍照；

11)以PBS置换一抗作为阴性对照，实验中每批细胞片做一张阴性对照。

12)IPP 6.0合成图片。