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以本实验室目前在做的基因工程菌为例（HX5/pET32a/BL21），该工程菌为氨苄青霉素抗性，其目的蛋白疏水性较强，含有二硫键，是包涵体表达，在诱导表达条件摸索时改变诱导条件依然为包涵体表达，最终对其包涵体纯化条件进行了摸索，确定了保菌、发酵、诱导、纯化、复性条件，如下： 1.工作库的建立 主代种子库取菌种5μL，加入到5 mL LB培养基中（含100μg/mL氨苄青霉素），37℃ 180 rpm培养过夜进行活化，次日将5mL活化菌种加入到50mL 含Ａ+的LB培养基中继续培养，37℃ 180 rpm，待OD600为1.0-1.5之间时（约2.5h）进行保存菌种：1.5mL EP管中加入300-400μL无菌甘油，再加入700μL菌液，标记好后统一封口膜封口，-80℃冻存备用。 2.种子培养 工作库取菌种10μL(1‰)，加入到10mL LB培养基中（含100μg/mL氨苄青霉素），37℃ 180 rpm过夜活化。 3.发酵及诱导 10mL种子液(1%)加入到1 L LB培养基中（该工程菌在TB培养基中发酵，虽能增加总表达量，但纯化后杂蛋白较多，故舍弃了TB培养基），180 rpm、 37℃培养4h（OD在3左右时），加入终浓度0.1 mM IPTG 180 rpm、 20℃诱导过夜。 4.收菌 7000 rpm离心20 min，收集沉淀，称重，TE缓冲液1：10重悬，7000 rpm离心20 min 洗涤一遍，TE缓冲液1：10重悬，备用。 5.超声破碎 冰浴下超声破碎，使用12号探头，输出功率90%，工作3s，间隔5s，每循环20 min，共超声5循环（超声破碎至完全澄清为止），12000 rpm 离心 20 min收集沉淀并称重。 6.包涵体洗涤 将沉淀用包涵体洗涤剂按照1：10重悬，包涵体洗涤剂组分为20 mM Tris/0.5% Triton X -100/1 mM EDTA/0.5 M NaCl（pH=8.5），洗涤方法为洗涤剂4℃磁力搅拌30min，超声2min，12000 rpm 离心 20min，收集沉淀再次重悬、搅拌、超声、离心，共洗涤5次，直至洗涤上清无颜色，最后一次洗涤后用TE缓冲液重悬，分装在50 mL离心管中（预先称空管重），离心后弃去上清，沉淀称重，-20℃冻存备用。 7.包涵体裂解 取一管冻存分装的洗后包涵体，按1：20加入裂解液，裂解液组分为6M盐酸胍（或8M脲，盐酸胍裂解效果更强一些，但对SDS-PAGE电泳有干扰）/20mM Tris（或20mM PBS，不同目的蛋白最适缓冲液不同）/2 mM咪唑（若目的蛋白和镍柱亲和力不强，则不加咪唑）/3mM DTT（DTT或2-Me，浓度需要摸索，目的是为打开二硫键，若目的蛋白无二硫键，可不加）pH=8.5，（不同重组蛋白适合的pH不同），4℃磁力搅拌过夜裂解，12000 rpm离心20min收集上清，0.22μm滤膜过滤后备用。 8.镍柱纯化 镍柱走纯化水10个柱体积→8M脲/20mM Tris/2 mM咪唑（需要根据自己目的蛋白摸索，一般0-5mM咪唑，防止杂蛋白非特异亲和镍柱，若目的重组蛋白与镍柱亲和力差则不加咪唑）/1mM 2-Me pH=8.5平衡液10柱体积→上样10mL（5mL柱体积的NI-NTA柱料，上海生工）→平衡液洗涤10柱体积→洗脱液（8M脲/20mM Tris/250 mM咪唑/1mM 2-Me pH=8.5）洗脱10个柱体积（摸索阶段要梯度洗脱，5、10、20、50、100、250、500mM咪唑，各梯度洗脱液电泳，确定目的蛋白最适的洗涤和洗脱咪唑浓度），同时收集洗脱峰→走水20柱体积冲柱→20%乙醇封柱4℃保存。(各液含1mM 2-Me，现用现加) 9.透析复性 洗脱液测蛋白浓度，装入透析袋，置于复性液（20mM Tris/1 mM EDTA/50 mM脲/2.2 mM GSH/1.1 mM GSSG/5%甘油 pH=8.5）中，4℃静置透析过夜。 10.二次透析 将透析袋放入新的透析液（20mM Tris/1 mM EDTA/50 mM脲 pH=8.5）中透析，换液三次。 11.保存 收集透析袋中液体，测量蛋白浓度和体积后，电泳检测目的蛋白纯度，并分装冻存于-80℃冰箱。 |
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