  上海欣软《动物行为实验手册》正在免费包邮发放中，《动物行为实验指南》是前者的进阶篇，全书预计600页+，内容更加详实严谨，印书版预计11月份完成，获取方式请关注公众号：脑声常谈的后续通知。  一个神经元的再生能力受到其内在环境和外在环境的控制。外周神经元和中枢神经元均表现出细胞类型依赖性的轴突再生，但其潜在机制尚不清楚。神经胶质为再生提供了一个必要的环境。然而，胶质-神经元信号通路的途径仍未被探索。 基于此，2023年10月14日美国费城儿童医院细胞和分子治疗中心在Nature communications杂志发表了“Glia instruct axon regeneration via a ternarymodulation of neuronal calcium channels inDrosophila”揭示了果蝇神经胶质细胞通过神经元钙通道的三元调节指导轴突再生。
在这里，作者发现再生特异性是由轴突切开术诱导的Ca2+仅在果蝇再生神经元中瞬变决定的，这是由l型钙通道介导的，构成了核心的内在机制。外周胶质细胞通过三层平衡调节调节轴突再生。神经胶质细胞来源的肿瘤坏死因子通过其神经元受体在损伤后维持钙通道的表达。神经胶质细胞通过向内整流的钾离子通道增强细胞膜的超极化来维持钙离子通道的开放。胶质细胞还释放腺苷，通过神经元腺苷受体发出信号，激活HCN通道并抑制Ca2+瞬变。作者确定了一个多面的胶质-神经元耦合，它可以促进神经修复。
图一 轴突再生依赖于神经元轴突切开术诱导的Ca2+瞬变 作者开发了一种钙成像的方法，允许在体内监测未麻醉的果蝇幼虫的活动。观察C4da和C3da神经元的Ca2+活性。野生型中未损伤的C4da神经元表现出相对恒定的低Ca2+水平，轴突切开术在整个躯体和过程中诱导了强烈的瞬变。Ca2+瞬变是在轴突切开术后特异性诱导的，而不是在仅损伤C4da神经元的单个或所有树突后才诱导的。接下来，作者检测了C3da神经元的钙活性。考虑到C3da神经元是机械敏感的，并且在成像过程中可以对幼虫的运动产生功能尖峰，在分析中只计算了没有任何幼虫运动的尖峰。未损伤的C3da神经元没有出现无运动的Ca2+瞬变，与C4da神经元相比，只有10%的损伤的C3da神经元出现峰值， C4da神经元特异性敲除Ca-α1Dand Ca-β，l型VGCC亚基，而不是Ca-α1T，抑制了轴突再生和Ca2+瞬态。在Ca-α1D功能缺失突变体中，进一步证实了再生和Ca2+瞬态的缺陷。过表达Kir2.140来降低膜去极化来抑制Ca2+瞬变显著抑制了轴突再生。
图二 Ca-β/Ca-α1D的比值对轴突的再生至关重要 作者进一步探究这些钙通道亚基在C3da和C4da神经元中的不同表达是否负责细胞特异性的再生模式。在未损伤的神经元中，Ca-α1D在不同亚型间有差异表达，在C4da神经元中高，而在C3da神经元中低，而Ca-β水平相当。轴突损伤后，C3da神经元的Ca-α1Dand Ca-β水平均显著降低。在损伤的C4da神经元中，Ca-α1D也减少了，而Ca-β则基本没有改变。Ca- β通过减缓Ca-α1D通道的失活来调节其活性。为了进一步验证最佳的Ca-β/Ca-α1D比值可能是轴突再生的先决条件这一假设，操纵了C3da和C4da神经元中Ca-α1D和Ca-β的表达。发现在C3da神经元中单独过表达Ca-β或Ca-α1D，通常是损伤后低水平的Ca-β和Ca-α1D，适度增强其轴突再生。Ca-α1D + Ca-β的过表达导致C3da神经元的再生潜能比邻近的C4da神经元更强。而在其非激活温度下过表达一般控制离子通道TrpA1并没有增加再生。与C3da相比，在C4da神经元中过表达Ca-β和/或Ca-α1D并没有促进它们的再生。相反，过表达Ca-α1D降低了再生，证实了Ca-β/Ca-α1D比值的降低损害了再生。然后，作者继续确定过表达Ca- α1D + Ca-β的C3da神经元是否能够产生类似于C4da神经元的轴突切开术诱导的Ca2+瞬态。没有观察到在静止的神经元中过表达后的峰值率增加。轴突切开术后躯体的Ca2+基线在过表达后增加了一倍，超过一半的损伤C3da神经元表现出WT中罕见的阈下瞬态。这些结果表明，Ca2+峰值本身可能并不需要轴突再生，而Ca-α1D + Ca-β过表达升高的基线和/或阈下Ca2+瞬变足以激活下游信号驱动再生。
图三 神经胶质TNF-α信号通路是轴突切开术诱导的Ca2+瞬变和轴突再生所必需的 胶质细胞对于轴突的再生是不可或缺的，作者之前的研究发现，如果伴随的胶质细胞同时受损，C4da神经元就无法再生。对C4da神经元进行钙成像，并进行胶质细胞标记。发现在对照损伤模式中，仍然包裹着C4da神经元体细胞和轴突，轴突切开术后Ca2+峰值被稳定诱导。然而，当作者通过靶向胶质突或胶质核损伤轴突外，还损伤胶质突，导致躯体和损伤轴突展开时，Ca2+瞬变现象被基本消除。与组织损伤对照组和对照组相比，只有不到30%的C4da神经元出现峰值，峰值率降低。为了寻找可能支持外周轴突再生的胶质-神经元相互作用，发现了TNF-α信号，该信号已被报道为果蝇神经肌肉连接处的一种前退行性机制。TNF信号通路与再生有关，在LoF突变体egr3中，果蝇TNF-αegr的缺失严重损害了C4da神经元轴突的再生，表明轴突大量停滞或收缩。结果表明，egr-wgn信号可能调节轴突再生独立于其调节神经元形态。
图四 神经胶质-神经元的egr-wgn信号通路是轴突切开术诱导的Ca2+瞬变和维持损伤后Ca-α1D表达所必需的 为了深入了解egrr-wgn在再生中的功能机制，作者测试了其在介导轴突切开术诱导的Ca2+瞬变中的潜在作用。发现神经胶质特异性敲除egr和C4da神经元特异性敲除wgn导致损伤后Ca2+瞬时受损。两者都降低了C4da神经元显示Ca2+峰值的百分比和总体峰值率。这些结果表明，神经胶质细胞释放的egr作用于神经元wgn受体，维持Ca2+瞬变，从而促进再生。为了确定egr-wgn信号通路如何调控Ca2+瞬变，作者重点研究了VGCC亚基的表达。分析显示，去除egr或wgn导致轴切后C4da神经元Ca-α1D mRNA转录本下降50%，而不影响Ca-β的表达。在egr3背景下，未损伤的mRNA水平不受影响，但在wgn RNAi背景下表达升高。作者过度表达Ca-α1D专门在C4da神经元egr3突变体，发现它能够挽救再生造成的再生不足，确认Ca-α1D位于egr-wgn轴的下游，TNF信号促进轴突再生调节VGCC表达和轴突诱导Ca2+瞬变。
图五 胶质向内整流钾通道允许神经元Ca2+瞬变和再生 C4da神经元在损伤后显示Ca2+峰值或爆发，先前在小鼠中的研究表明，破裂可能发生在神经元中的VGCCs和胶质细胞中的内部整流钾通道中，如Kir4.1。Kir4.1介导神经元-胶质紧密连接处K+的胶质去除，降低输出并使神经元静息膜电位超极化，导致神经元VGCCs失活。通过胶质特异性敲除Irks，发现与WT相比，Irk1 LoF的C4da神经元轴突再生明显减少。另一方面，通过胶质细胞过表达Irk1-wt，Irk1的功能获得适度但显著地增加了再生C4da神经元ddaC的轴突再生程度，但不影响整体再生百分比。这些结果表明，胶质Irk1对于促进轴突再生是必要的。Irk1的胶质细胞敲除并没有严重改变C4da神经元的胶质细胞包裹和形态。这些结果表明，胶质Irk1通道的K+缓冲能力对于维持损伤诱导的C4da神经元的Ca2+瞬态和随后的轴突再生至关重要。RNAscope分析显示，Irk1mrna在C4da神经元体细胞或近端轴突周围基本缺失，但沿中间轴突延伸以包的形式富集，与包裹胶质细胞覆盖的结构域重叠。在轴突切开术后，Irk1 mRNA的分布保持相似，并且在轴突尖端周围或前面的神经胶质突起中观察到富集。
图六 胶质-神经元腺苷信号通过AdoR和Ih离子通道抑制轴突再生 在确定了通过膜兴奋性对轴突再生的直接调控后，作者开始对神经元膜电位操纵影响VGCC激活的可能性产生了兴趣。ATP的释放已被证明通过腺苷激活的A2aR产生cAMP来影响神经元的兴奋性。特异性敲除AdoR轴突再生明显增加，去除Ih同样促进了LoF突变体Ihf03355和C4da神经元敲除的C4da再生。用两个RNAis来敲除AdoR，也显示了再生能力的增加，提示可能与神经胶质腺苷自分泌信号的反馈独立于神经元Ih。这些结果表明，AdoR-Ih轴抑制了C4da和C3da神经元的轴突再生。C4da神经元特异性敲除Ih显著增加了轴突切开术诱导的Ca2+瞬变的速率，而没有改变总体峰值百分比或速率。Ih敲低并没有增加峰值神经元的百分比，这表明该通道仅在减弱Ca-α1D和Ca-β水平足够的神经元的Ca2+峰值中发挥作用，而不影响不能达到峰值的神经元。AdoR-Ih轴可能通过抑制Ca2+的瞬变来抑制轴突的再生。 这项工作的发现也显示了许多潜在的治疗靶点，既可以激发静态神经元的轴突再生，又提高神经元的再生能力。通过这项研究，作者确定了损伤后神经元Ca2+瞬态的复杂控制，这可能会分别通过哺乳动物Kir4.1和HCNs影响哺乳动物抑郁症和癫痫的神经元再生。损伤后触发神经胶质TNF-α和ATP释放的因素尚不清楚。同样，未来的研究揭示这些Ca2+瞬变的下游因素将有助于理解轴突再生。  https:///10.1038/s41467-023-42306-2 特别鸣谢 |
|
|
