免疫组化基础学习笔记1

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01

免疫组化技术的基本原理及应用

（一）定义：

利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位，定性及定量的研究称为免疫组织化学技术（IHC）。

按照标志物的种类可分为免疫荧光法，免疫酶法及免疫金法等。

目前使用广泛的：过氧化物酶-过氧化物酶（PAP）法、卵白素-生物素-过氧化物酶（ABC）法、链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶连接（SP）法。

（二）基本原理

抗原与抗体之间的结合具有高度的特异性。

免疫组化正是利用这一特性，先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶或生物素等处理后，再与前述抗原成分结合，将抗原放大。

由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此还必须借助于免疫组织化学将抗原抗体反应部位显示出来。常用显色剂DAB显示为棕黄颗粒。

（三）分类

1.按标志物质的种类：如荧光染料，放射性同位素，酶等，可分为免疫荧光法，放射免疫法，免疫酶标法和免疫金银法等。

2.按染色步骤：可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。

3.按结合方式：可分为抗原-抗体结合，如PAP法；亲和连接，如ABC法、SP法。其中SP法是比较常用的方法。聚合物连接。

（四）免疫组化技术的优点

1.特异性强。

2.敏感性高。

3.定位准确、形态与功能相结合。

（五）免疫组织技术在临床诊断中的作用

1.用于疑难病例的诊断与鉴别诊断。

2.对“未分化”恶性肿瘤的分类。

3.协助确定肿瘤的良恶性。

4.确定来源不明的转移瘤的原发部位。

5.对肿瘤进一步病理分型。

6.发现微小转移灶。

7.确定肿瘤分期。

8.肿瘤预后判断。

9.指导靶向治疗。

10.病因和发病机制研究。

（六）免疫组织化学的局限性。

在免疫组化操作方面，主要的表现为假阳性和假阴性、组织块和抗体的选择等。

1.造成假阳性的主要原因包括：一抗浓度不合适、孵育时间过长、试剂没有完全的覆盖组织、在操作中组织变干等。

2.造成假阴性的主要原因包括：抗原修复的方法不正确、一抗本身失效等。

因此，在免疫组化操作中，必须有适当的阳性与阴性对照。

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02

在临床病理诊断中如何正确应用免疫组织化学技术 

病理医师要充分了解免疫组化存在的缺陷及由此造成的误区，要恰当的选择组织块，按照交叉阳性的原则，选择一组合适的抗体。

在评价结果时，首先应该检查染色反应是否成功，其次要分析阳性染色的部位是否正确，还要结合he染色确定免疫反应阳性的组织或细胞是否为肿瘤或有意义，以免误诊。

（一）组织块的选择。

1. 首先有典型病变、组织细胞形态完整、固定较好的组织块，有正常组织、肿瘤组织及内对照者优先选择。

2. 注意肿瘤的异质性，可选择多个组织块。

3. 对固定时间较长或未及时固定的组织，冻融后的组织或脱钙后的组织应尽可能地避免使用。

4. 用于IHC染色者切片厚度以3~5微米为宜。

（二） 免疫组化抗体的选择策略。

1. 一般来讲，对抗体的选择是建立在对形态初步判断基础上的选择抗体是为证实形态学的判断或辅助形态学进行鉴别诊断的选择策略大致可分为：

（1）充分了解病史，肿瘤部位初步评估肿瘤的性质。

（2）通过认真观察he切片并联系临床相关信息，准确地列出初步诊断及几种鉴别诊断意见。决定抗体联合配套使用。（首选抗体中至少应用两个抗体联合检测，鉴别诊断的抗体应选敏感性强及广谱的抗体。为了尽量避免得到片面的结果，从而造成错误的解释，得出错误的结论，做免疫组化时常常需要配套的选择抗体，很少仅用单一抗体）。

2. 根据HE形态学观察得不出初步的肿瘤的性质时，先采用一线抗体，确定一定的范围。再应用二线抗体、三线抗体最后得出结论。

（三）   设立阳性对照和阴性对照。

1． 阳性对照的选择。在免疫组化结果出现无信号时，阳性对照的设立可为查找原因，提供重要线索。

2． 阴性对照的选择。有两种，一种是自身对照，一种是外部对照。一般自身对照比较常用，在同一张测试片上做，减少了操作误差，结果也更可靠。

（四）   免疫组化染色过程中常见问题及处理原则。

1．假阴性。为抗体标记的切片无阳性信号，都是阴性，结果缺乏真实性。

（1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。

（2）组织内待测定抗原已被分解破坏或抗原含量过低。

（3）抗原被遮盖。

（4）抗体质量不佳或稀释度不当。

（5）技术操作失误等。

   解决阴性染色的问题，就是设立阳性对照.

2.假阳性。真阳性染色结果，应该表达在预期对应的组织抗原中，定位清晰，准确。假阳性一般出现在非预期对应的组织抗原中，即由于背景着色、边缘效应或着色不均匀导致的阳性信号不确定。

（1）抗体与非待检抗原发生交叉反应。在使用多克隆抗体时易出现。

（2） 组织对抗体的非特异性吸附，特别是在有大片组织坏死或组织中有较多富于蛋白的液体时，容易发生。

（3） 内源性过氧化物酶的作用。在脾脏，骨髓以及一些炎性细胞组织的染色中易出现，内源性碱性磷酸酶的作用，特别是肠黏膜上皮和近曲小管刷状缘，有高浓度的碱性磷酸酶，若处理不彻底，易出现假阳性结果。

（4） 判断失误，将肿瘤组织中残留的正常组织的免疫组化阳性信号误认为是肿瘤的染色反应。

（5） 当肿瘤浸润破坏正常组织时，被破坏的正常细胞胞质内的可溶性蛋白释放，后者被肿瘤细胞非特异性吸附或吞噬，使肿瘤细胞出现该种抗原的阳性反应。

（6） 外源性和内源性色素的干扰。

3. 非特异性染色。是免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色。可能的原因有操作过程中冲洗不充分，组织中过氧化物酶未阻断（可在配置新鲜3%的过氧化二氢封闭，时间延长），组织中含内源性生物素，血清蛋白封闭不充分，一抗的使用浓度是否过高。

4. 染色弱。可能的原因有抗体浓度过低，孵育时间过短，试剂超过有效期。操作中滴加试剂时缓冲液未沥干，室温太低，蛋白封闭过度，若标本弱阳性，则可能由阳性对照不是同一种组织或固定方法不同等原因造成，不适当的抗原修复方式。

5. 染色过强，抗体的浓度过高或时间过长，温度过高。

6. 花斑状着色，原因有脱蜡不净，切片厚薄不均。

7. 边缘效应。

（五）   分析和判读的步骤。

（1） 免疫组化结果的判断原则。

1.必须设染色对照

2.抗原表达必须在特定的部位

3.阴性结果不能视为抗原不表达：阴性结果不能认为具有否定意义。阳性表达有强弱多少之分，哪怕只有少数细胞阳性，也要视为阳性表达，不能认为个别细胞阳性而不做阳性看待。

4.免疫组化与HE切片诊断，应以HE切片诊断为准。

（2）分析和判读的步骤。

判定染色是否成功：判断着色细胞的类型。判断着色的亚细胞定位。阳性细胞组织学分布（局造型，弥漫型，网状型，腔缘型）。

标志物阳性程度的判断：观察切片由低倍到高倍确认研究细胞，剔除非研究细胞。标注物阳性程度的判断。着色强度、阳性细胞数在同类细胞中所占比例多少、采用积分综合计量表。

参考资料：实用免疫组化病理诊断