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上次，我们详细分享了免疫组织化学（IHC）的基本原理和操作流程。今天主要介绍免疫组化结果的判读。拿到染色的IHC片，我们如何判读染色结果，是否理想，是否达到预期效果呢？下面我们逐一来看： 一、染色结果准确性分析  对照设置：IHC实验必须同时设计阴性、阳性对照，以保证染色结果的可靠性和特异性。此外，根据不同实验要求还会设计替代对照、空白对照、抑制对照等。 对照结果：正常情况下，阴性对照不含目标抗原，染色后不着色；而阳性对照在细胞特定部位着色。在阴性、阳性对照均正确着色的前提下，才能进一步判断实验样本结果。 背景染色：免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，是非特异性的，会严重干扰IHC染色结果的正确判断，应尽量避免。其产生原因可能包括：① 内源性干扰 (肝、肾等组织富含内源酶、生物素等吸附性强并催化DAB显色)；② 试剂原因 (抗体特异性较差、抗体与其他抗原存在交叉反应、抗体浓度不合适等)；③ 标本前处理不当 (组织固定不及时或固定不良所导致，细胞自溶抗原弥散移位等)；④染色过程操作不规范 (PBS洗涤不充分、组织干涸、抗原抗体孵育时间过长等)；⑤DAB试剂使用不当 (显色时间太长、DAB非新鲜配制）。 二、阳性标记样本的结果判断 对于实验样本的IHC结果，主要从定性、定量和定位三个方面判断。定性是指染色结果为阳性或阴性；定量是指阳性细胞的密度（百分比）和染色强度；定位是指阳性细胞在组织细胞中的形态、分布特定。1. 阳性标记的定性判断（DAB标记为例） 在IHC片上，根据标本抗原多寡会在细胞特定部位由浅到深呈浅黄色-棕黄色-棕褐色粗颗粒。评分为：0分 (阴性, 无黄色)，1分 (阳性, 浅黄色)，2分 (阳性, 棕黄色)，3分 (阳性, 棕褐色)。  2. 阳性标记的定量判断（DAB标记为例） 阳性细胞的密度在低倍镜下，根据阳性细胞占总细胞数的比例 (例如IHC标记阳性肿瘤细胞占所有细胞的比例)，≤25% 为1分, 26%～50%为2分, 51%～75%为3分, 76%～100%为4分。3. 阳性标记的定位判断 根据抗原在特定细胞中的分布，分为①胞膜型, ②胞质 (浆)型, ③胞核型, ④微绒毛型, ⑤复合型(胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有)五种阳性细胞类型。  根据阳性细胞呈现组织学特点，分为局灶型、弥漫型、网状型等。①局灶型：阳性瘤细胞呈不规则小灶性分布。阳性细胞可多可少，排列不规则，无固定排列形式，阳性染色深浅不一；②弥漫型：阳性细胞呈弥漫性分布，细胞间无连接，也可以单个细胞散在分布；③网状型：主要见于细胞密度较大的大细胞肿瘤。标记物多为膜抗原；④腔缘型：阳性颗粒主要位于腺癌腔缘的微绒毛处。三、 阳性标记结果的计算 目前，IHC阳性标记结果大多采用积分综合计算。计算公式为：阳性标记颜色分值*阳性细胞的比例分值，cutoff值一般在6-7之间，低于cutoff值为低表达，反之为高表达。下面我们以几张图为例，演示计算方法。  图1 乳腺癌中HER2蛋白的表达（胞膜型）表1 乳腺癌HER2蛋白的阳性表达计算 序号 颜色深浅 阳性比例 综合评分 a 0 0 0 b 1 2 2 c 2 3 6 d 3 4 12  图2 肺癌中ALK蛋白的表达（胞浆型）表2 肺癌ALK蛋白的阳性表达计算 序号 颜色深浅 阳性比例 综合评分 a 0 0 0 b 1 3 3 c 2 4 8 d 3 3 9 上述方法判断主要依靠判断者主观感受；同一样本给不同判断者判读，其可能存在一些差异。现在也有学者利用ImageJ软件对IHC结果进行分析，感兴趣的果友可去知乎学习。 推荐链接：https://zhuanlan.zhihu.com/p/83654843。 此外，我们借助生信论文20的结果（生信分析20：CDK5与肾癌的生信分析），重点分享如何进行免疫组化结果的呈现。这篇生信论文是探究细胞周期蛋白CDK5在肾癌中的标志物价值，是生信和湿实验结合的论文。生信部分主要是下载了TCGA和GENT、Oncomine中的数据，然后借助SPSS软件进行数据分析和呈现。  论文中的湿实验部分也都是常规实验，包括RT-PCR、Western Blot和免疫组化染色 (IHC)。Fig1，从TCGA和GENT下载原始数据，进行统计分析。图A是散点图，图B是从GENT下载，然后借助SPSS个性化处理的。图C和图D是用临床样本验证，RT-PCR和WB的结果同时呈现。整体来说，蛋白表达的差异具有异质性。  为了增加研究的深度，作者将CDK5与明星分子p21联系起来。那么为什么选择p21呢？论文在Introduction部分给出了阐释：Recent studies have revealed that CDK5 suppressed the activities of several cell cycle inhibitors such as p21 and p27, and leading to the over proliferation of cancer cells. 由于CDK5和p21都是胞内蛋白，免疫组化检测其表达是首选。文章呈现免疫组化结果的方式，也是值得我们学习和借鉴的。  首先，在呈现免疫组化结果时，要全景图和局部放大图相结合；标尺或放大倍数要写明；肿瘤组织还是癌旁对照组织要标明；抗体名称和抗体使用时的稀释倍数也要写明，这样再呈现出来，绝对是很好的免疫组化数据。如果能将所有标本中到蛋白表达的水平按照高、中和低水平进行分类（作者在补充数据中呈现了），如果再做个统计图，那就更好了。  这篇干湿结合的论文，其中免疫组化结果的呈现还是挺棒的！因为像素问题，上述免疫组化结果的判读就不展开了。下周，我们将结合实际素材分享免疫组化结果的判读。参考文献： 马大烈,白辰光.免疫组织化学阳性标记结果的观察和判断[J].临床与实验病理学杂志, 2003(05):557-559. 李明凤,方林娜.前列腺癌组织中TEM8与VEGF的表达及临床意义[J].临床与实验病理学杂志, 2020, 36(10):1144-1148. 贾茹,王理.胃癌组织中EPAS1的表达及临床意义[J].临床与实验病理学杂志, 2022,38(10):1193-1197+1203. 生信分析20：CDK5与肾癌的生信分析 资源共享 | 生信百篇、癌生物学最终链接 |
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