编译：微科盟猫猫，编辑：微科盟居居、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。 导读氮循环作为地下水中重要的生物地球化学过程，对地下水生态的能量流和物质流具有重要影响。北京地下水中邻苯二甲酸酯(PAEs)是影响地下水微生物群落结构和功能的关键环境胁迫因子；因此，可以推断这些胁迫源可能影响几乎完全由微生物介导的氮循环。确定PAEs对地下水氮循环的影响并探索潜在的影响机制和途径是至关重要的，但仍然具有挑战性。本研究采用高通量测序和生物信息学分析并结合中介分析方法，探讨环境胁迫源PAE对北京某典型监测站地下水氮循环的影响机制和途径。结果表明，在检测到的5种PAEs中，邻苯二甲酸二甲酯和邻苯二甲酸二乙酯对地下水氮循环过程(特别是固氮和反硝化过程)有显著的负面影响(p < 0.05)。它们的影响完全或部分由功能微生物介导，特别是关键属(如脱氯单胞菌(Dechloromonas)、气单胞菌(Aeromonas)和Noviherbaspirillum)，这些PAEs通过碳水化合物代谢失调和防御机制激活显著抑制其丰度。这些结果证实了环境胁迫源PAEs对地下水氮循环的影响可能是通过“PAE胁迫-地下水微生物组-氮循环改变”途径介导的。本研究有助于加深对环境胁迫源对地下水生态影响的认识，为地下水胁迫源的生态危害评估提供支持。
图文摘要 原名：Environmental stressors altered the groundwater microbiome and nitrogen
cycling: A focus on influencing mechanisms and pathways 译名：环境胁迫改变地下水微生物组和氮循环：影响机制和途径
期刊：Science of The Total Environment
IF：9.8
发表时间：2023.9
通讯作者：王金生，李剑
通讯作者单位：北京师范大学水科学研究院
DOI号：10.1016/j.scitotenv.2023.167004
本研究在地下水样品中检出了15种PAEs中的5种，分别为邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)。PAEs总浓度(ΣPAEs)范围为5.37 ~ 21.16 µg/L。根据PAEs的浓度和组成变化，将地下水样品分为2类：1类(A1、A2、A3、A4、B1、B2和B3)，DMP、DEP和ΣPAEs的浓度高于2类(B4、C1、C2、C3、C4)；p < 0.05)，如图S2所示。通过KEGG途径注释和富集分析，在所有地下水样品中注释了主要的氮转化功能，包括固氮、反硝化、硝化、同化亚硝酸盐还原和异化硝酸盐还原成铵(DNRA)(图1A)。在这些功能中，反硝化被确定为主导功能，占总氮转化功能的54.2%(图1B)。然后，识别出10个参与反硝化过程的功能基因，如图1C所示。这些基因的相对丰度排序如下：narH、narG、norB、narI、norC、nirS、napB、napA、nosZ、nirK；其中，narH和narG丰度最高，占总反硝化功能的百分比＞20%。随后，对不同类别间氮转化功能的丰度和组成进行差异分析，结果如图2A所示。1类的固氮和反硝化功能显著低于2类(p
< 0.05)(图2 a)；1类中反硝化基因(napA、napB)和固氮基因(nifH、nifD、nifK)的丰度显著降低(p < 0.05)(图2B，2C)，表明PAEs可能抑制地下水的固氮和反硝化功能。此外，还建立了地下水样品中氮转化功能与环境参数之间的关系。RDA结果表明，11个环境参数(pH、ORP、DOC、NO3-、NO2-、NH4+、DMP、DEP、DIBP、DBP和DEHP)可以解释反硝化固氮基因总方差的86.03%，图3A)。其中pH、DMP和DEP被认为与这些基因显著相关(p
< 0.05)。此外，DMP、DEP和ΣPAEs与反硝化基因(napB、napA、nosZ、nirK)和固氮基因(nifH)的相对丰度呈负相关，如图3B所示。结果表明，两类地下水样品在氮转化功能，尤其是反硝化和固氮功能上存在显著差异，这种差异可能与PAEs的组成和浓度不同有关。 
图1. (A)通过KEGG途径注释和富集分析揭示的地下水主要氮转化功能示意图；(B)地下水中主要氮转化功能丰度百分比；(C)每个采样点反硝化功能基因的丰度百分比。ANR和DNRA分别表示同化亚硝酸盐还原和异化硝酸盐还原为铵。
图2. 1类与2类氮转化功能(A)、反硝化基因(B)、固氮基因(C)丰度差异分析(*p < 0.05；**p < 0.01)。ANR和DNRA分别表示同化亚硝酸盐还原和异化硝酸盐还原为铵。
图3. (A)氮转化功能基因与环境参数的冗余分析。绿色箭头表示环境参数，长度越长表示影响越大。(B)功能基因与功能微生物/PAEs的Spearman相关性分析。红圈和蓝圈分别表示正相关和负相关(*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001)；R为相关系数。经过分类鉴定，在所有地下水样品中鉴定出固氮和反硝化功能基因分属6门34属。在门水平上，大多数功能基因在变形菌门中被发现，占总微生物丰度的96.8%(图S3)。此外，筛选出相对丰度>1%的12个属作为具有代表性的微生物类群，其在地下水样品中的组成如图4A所示。在属水平上，Vogesella(30.06% ~ 36.28%)、气单胞菌(Aeromonas，11.61% ~ 17.94%)、Sulphicurvum(4.66% ~ 20.66%)和假单胞菌(Pseudomonas，19.26% ~ 5.73%)占总分配微生物丰度的65.58%以上。方差分析显示，1类和2类分配功能微生物的群落结构存在显著差异(p < 0.05；图4b)；其中，Vogesella、Aeromonas、Sulphicurvum、脱氯单胞菌(Dechloromonas)、食酸菌属(Acidovorax)和Undibacterium 6个属的丰度在第1类中显著低于第2类(p <
0.05；图4 b)。此外，相关热图分析证实，大多数功能微生物的丰度与PAEs浓度呈显著负相关(p < 0.05)。其中，优势菌属与PAEs之间共有11个显著负相关关系(p
< 0.05；图4C)，表明PAEs的组成和浓度差异可能是影响功能微生物组成和丰度的重要因素。 
图4. 1类和2类固氮反硝化功能微生物属水平组成分析(A)和差异分析(B) (*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001)。(C) PAEs与功能微生物的Spearman相关性分析。红圈和绿圈分别表示正相关和负相关(*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001)；r表示相关系数。3 PAEs对氮转化功能影响的分类特征鉴定和生物地球化学过程3.1 微生物组在PAE胁迫与氮转化功能关联中的中介效应为了研究PAEs对氮转化功能的潜在影响机制，基于共现网络分析，可视化了5个PAEs与所有分配功能微生物和功能基因之间的联系(图5A)。该网络由53个节点和220条边组成。其中，PAEs主要与微生物类群和功能基因呈显著负相关，而微生物类群与功能基因主要呈显著正相关(p
< 0.05；表S2)。有趣的是，基于网络的拓扑特征，这些属不仅包括优势属(如Vogesella、Acidovorax、Aeromonas、Sulphicurvum、Decchloromona、Undibacterium)，也包括非优势属(如Noviherbaspirillum)，它们被认为是共现网络中的关键属，表现出高中介中心度和低接近中心性值(中介中心性≥5，接近中心性≤0.6，表S3)。同时，主要关键属与DMP、DEP及多种功能基因也存在显著相关性(p < 0.05，图5A)。因此，根据网络中节点的度进一步筛选这些关键属和排名靠前的功能基因，并将其用于后续的中介分析。随后，中介分析支持了关键属在PAE胁迫和功能基因改变之间的中介效应。计算指标如表1所示，其间接效应和直接效应均具有统计学显著性。在中介比例内筛选到12个具有统计学意义的模型，支持这些属在PAE污染与氮转化功能改变之间的关联中起中介作用。介导比例在30.9 ~ 100.0%之间，表明PAE胁迫与氮转化功能改变之间的关联全部或部分由这些属的变化介导。其中，Dechloromonas丰度介导了DEP胁迫与napA/B的关系，介导比例为100% (p <
0.05)；另一方面，Aeromonas丰度部分介导了DEP胁迫与napA之间的关联，介导比例为43.9% (p < 0.05)。这些结果支持了“PAE胁迫-地下水微生物组-氮循环改变”途径。 
图5. (A) PAEs、所有分配功能微生物和功能基因之间的共现网络分析。(B) PAEs、所有分配功能微生物和差异COGs之间的共现网络分析。红色和蓝色的线分别表示正相关和负相关。 表1 微生物组在PAE胁迫与氮转化功能关联中的中介效应。
3.2 PAE胁迫下碳水化合物代谢和防御功能的激活导致微生物组的改变为了研究PAEs调控微生物组的生物地球化学过程，进行了功能注释和差异分析。结果显示，PAE浓度较高的第1类功能核心“碳水化合物运输和代谢”和“防御机制”的丰度显著高于第2类（p<0.05；图S4）。进一步分析支持DMP和DEP显著升高了关键代谢酶的基因丰度(p <0.05；图6A, 6B)，例如，葡萄糖脱氢酶(COG4993)、磷酸烯醇丙酮酸合成酶(COG0574)和5-methylthioribulose(COG0235)等，同时显著上调了ABC型抗菌肽转运系统(COG0577)、ABC型多药转运系统(COG0842、1131和1132)和ABC型脂蛋白输出系统(COG1136)等ATP结合盒转运系统的基因丰度(p < 0.05)，表明这些差异基因及其功能可能与微生物组的PAE胁迫有关。此外，共现网络分析验证了PAEs与差异COGs (COG4993、COG0574、COG0235、COG1472、COG0726、COG1109、COG1653、COG0524；COG1968、COG0577、COG1680、COG0842、COG1136、COG1131、COG1132)和功能微生物之间的联系。DMP和DEP可以直接影响这些差异功能，呈现显著正相关关系(p <0.05，图5B和表S4)，而这些功能与功能微生物(尤其是关键属)呈显著负相关(p <0.05)，如图S5所示。这些结果支持PAEs对功能微生物的胁迫可能与干扰碳水化合物代谢和防御功能有关。 
图6.1类和2类之间“碳水化合物运输和代谢”(A)和“防御机制”(B)功能的前15个COGs丰度差异分析(*p < 0.05；**p < 0.01)。PAEs是一种广泛出现的污染物，已在包括地下水含水层在内的水生环境中发现。本研究中检测到的∑PAEs(5.37-21.16 µg/L)与波兰垃圾填埋场下游监测井(＜LOD–27.9±6.64 µg/L)以及我国滹沱河冲积扇深浅孔隙水(＜LOD–25.237 µg/L)相当，但高于我国东莞浅层地下水(<LOD–6.7 µg/L)。本研究为北京市地下水中PAE污染提供了证据，揭示了北京市含水层对PAE污染的脆弱性。本研究的发现得到了Dong等人的支持，他们审查了中国地下水中的PAE污染物，并提出PAEs可以迁移和渗透含水层系统，导致地下水污染。同时，Dueñas-Moreno等人表明，人为活动可能导致PAEs从地表环境(空气、地表水和土壤)长期输送到地下水库；例如，人工地下水补给和垃圾填埋场渗滤液的分散是造成这些污染物污染地下水的重要原因。PAEs引起广泛关注的原因通常是其潜在的健康危害；事实上，这些污染物不仅对健康有危害，而且对环境也有危害。因此，有必要对这些污染物在地下水中引起的生态后果进行研究。本文集中研究了PAEs对氮循环的影响，结果表明PAEs可能干扰地下水氮转化功能，高PAE污染组反硝化和固氮基因丰度较低PAE污染组显著降低，反映了PAE对这些功能的负面影响。在其他环境介质中也提出了支持性证据。例如，有报道称PAE显著降低了重黑臭河流沉积物中反硝化基因的丰度，这与本研究结果一致。此外，Xu等人和Kong等人也报道了湿地和农业土壤中PAEs对氮循环的影响，包括反硝化和固氮过程。目前对地下水污染评价的认识主要基于健康风险，忽略了对生态影响的评价。考虑到地下水生态系统是地球生态系统的重要组成部分，提供多种生态系统服务，如维持元素循环，然而自然事件或人类活动对地下水生态系统的压力不可避免地导致生态系统服务破坏。因此，了解污染物对地下水生态系统的长期影响是必要的。据我们所知，本研究首次建立了北京地下水中PAE胁迫源与氮转化功能变化之间的关系，并提供了支持这些新兴污染物对地下水生态系统功能影响的证据，建议采用生态评价作为健康风险评价的补充，以更深入和全面地了解地下水胁迫源。2 “PAE胁迫-地下水微生物组-氮循环改变”途径本研究发现微生物组在环境胁迫因子与氮循环改变之间的中介效应。有趣的是，微生物群分布，特别是Dechloromonas、Aeromonas和Noviherbaspirillum，在DMP和DEP胁迫源与氮转化功能之间表现出全部或部分的中介作用。这些结果支持“PAE胁迫-地下水微生物组-氮循环变化”途径可能是PAE胁迫与氮循环变化关系的可能机制。虽然已经提出微生物组作为将环境胁迫因子和生态后果联系起来的中介的重要作用，但量化中介效应的研究很少。早期的研究大多侧重于揭示环境胁迫源对微生物组或其功能的影响。例如，有报道称抗生素土霉素会抑制厌氧氨氧化菌的生长，并对厌氧氨氧化过程产生负面影响，但没有构建影响途径。本研究是第一个利用反硝化和固氮作为生态结果来确定PAE胁迫途径的研究。PAEs调控地下水反硝化固氮过程的关键类群包括优势类群(如Aeromonas、Dechloromonas)和非优势类群(如Noviherbaspirillum、Tolumonas)。Bose等人报告了类似的结果，支持土壤微生物组的稀有类群成员对于催化水稻土中的氮生物地球化学过程是必不可少的。Liang等人甚至发现土壤微生物稀有分类群成员中氮转化基因的丰度高于丰富分类群成员，并认为稀有分类群成员在支持氮的生物地球化学循环方面可能比丰富分类群成员更活跃。重要的是，本研究的结果支持PAEs显著负面影响这些关键属的丰度。虽然PAE污染引起地下水中参与氮循环过程的微生物属变化的研究较少，但PAE的抗菌特性已经得到证实。例如，一些PAEs已被报道能显著抑制Aeromonas hydrophila(Aeromonas的一种菌株)的生长。此外，这些化学物质被证明可以诱导细菌物种的形态变化、膜损伤和氧化应激。特别是，Wang等人揭示了PAE对去除废水中总氮的负面影响，他们指出，这些化学物质通过抑制关键反硝化菌的增殖，显著降低了城市污水系统去除总氮的性能，支持了本研究的结果。因此，在本研究中，PAEs对这些功能微生物的负面影响可能归因于其生物毒性。3 PAEs通过激活碳水化合物代谢和防御功能调节地下水微生物组本研究结果支持PAEs激活地下水微生物组的“碳水化合物运输和代谢”和“防御机制”。You等人观察到类似的结果，发现PAEs加速了碳水化合物代谢，诱导了碳水化合物活性酶的丰富度，支持PAE污染物促进黑土微生物的能量产生和转化。事实上，已经提出充足的能量是微生物生长、繁殖和应对环境胁迫的必要条件。Zaidi等人通过对耐药菌株的分析揭示了微生物在环境胁迫下生存的获得性策略，证明了微生物的生存与代谢变化和多种防御反应有关；特别是，对外源污染物的防御反应的启动已被确定为主要决定因素。本研究还发现，在PAE浓度较高的组中，一些与“防御机制”相关的功能也有所增强，如ABC型抗菌肽转运系统(COG0577)、ABC型多药转运系统(COG0842、1131和1132)和ABC型脂蛋白输出系统(COG1136)。ABC转运系统可以将非常广泛的重要分子转移到细胞内外，并可以保护细胞免受有害外源物的侵害。与本研究的结果相似，ABC转运系统的激活在以前的研究中也有报道。例如，在长期暴露于胆汁酸后，耐药菌株Lactococcus
lactis中ABC型多药转运蛋白及其介导的外排增加，这在改善对该化合物的耐药性中发挥了核心作用。Xu等人也报道了DBP增加了黑土微生物ABC转运体的总基因丰度，从而改变了土壤微生物群落。由此可以推断，地下水中碳水化合物代谢和防御功能的激活可能导致了地下水微生物群落结构的转移。除了抗性外，“碳水化合物运输和代谢”和“ABC转运系统”也对微生物的生长进行调节，从而参与PAEs诱导的细菌生长抑制。Wang等人观察到暴露于DMP后荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的生长受到极大抑制，并根据RNA-Seq和RT-qPCR数据表明，抑制反应与能量代谢紊乱和ABC转运系统改变有关。此外，有研究表明，DMP对ABC转运系统的失调与膜蛋白刚性和稳定性的改变、对底物识别和转运的影响以及随后对细菌生长的抑制有关。因此，代谢和ABC转运系统的变化可能会抑制地下水中微生物的生长或对其增殖产生负面影响，这可以解释PAE胁迫与这些关键微生物丰度之间的负相关关系。本研究建立了PAE胁迫、微生物群落变化和氮循环变化之间的相关性，并基于基因组学数据和模型分析确定了所涉及的分类学特征和生物地球化学过程，提高了对环境胁迫源对地下水生态影响的认识，为地下水关键污染物的生态影响评价提供了理论支持。值得注意的是，本研究的结论主要是基于高通量测序和模型模拟的数据得出的；因此，基于纯培养微生物(例如，筛选的中介菌株)的进一步研究应该在未来进行验证。此外，本研究的结论并不排除其他途径对PAE对氮循环的影响；下一步，需要进行更详细的研究，以认识地下水中PAE胁迫与生态后果之间的多种途径。本研究结果表明，PAE环境胁迫因子显著影响了地下水氮循环过程，尤其是固氮和反硝化过程(p <
0.05)。同时，PAE胁迫通过调节微生物碳水化合物代谢和防御功能，显著改变了微生物群落结构，并改变了关键微生物的丰度(p < 0.05)。重要的是，微生物组的改变有助于PAEs对氮循环的影响。最终构建了“PAE胁迫-地下水微生物组-氮循环改变”途径，有助于了解PAEs对地下水氮循环的影响机制。原文链接：https://www./science/article/abs/pii/S0048969723056292获取此篇微文原文pdf请扫描下方二维码联系微科盟多组学老师即可。
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