重磅科研丨Nature(IF:64.8): 肠道微生物碳水化合物代谢导致胰岛素抵抗

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编译：微科盟yl，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

胰岛素抵抗是代谢综合征和2型糖尿病的主要病理生理学基础。先前的宏基因组研究已经描述了肠道微生物群的特征以及其在胰岛素抵抗中代谢主要营养物质的作用。特别是，共生菌群的碳水化合物代谢被认为贡献了宿主总能量提取的10%，从而在肥胖和糖尿病前期的发病机制中发挥作用。然而，其潜在机制尚不清楚。本研究使用一种全面的多组学策略在人体内调查了这种关系。将无偏的粪便代谢组学与宏基因组学、宿主代谢组学和转录组学数据相结合，以了解微生物组在胰岛素抵抗中的作用。这些数据表明，粪便中的碳水化合物，特别是宿主可利用的单糖，在胰岛素抵抗个体中增加，并与微生物碳水化合物代谢和宿主炎症细胞因子有关。本研究鉴定了与胰岛素抵抗和胰岛素敏感性相关的肠道细菌，它们显示出不同的碳水化合物代谢模式，并在小鼠模型中证明与胰岛素敏感性相关的细菌可以改善胰岛素抵抗的宿主表型。本研究为胰岛素抵抗中宿主-微生物关系提供了一个全面的视角，揭示了微生物群对碳水化合物代谢的影响，为改善胰岛素抵抗提供了潜在的治疗靶点。

论文ID

原名：Gut microbial carbohydrate metabolism contributes to insulin resistance

译名：肠道微生物碳水化合物代谢导致胰岛素抵抗

期刊：Nature

IF：64.8

发表时间：2023.8

通讯作者：Tetsuya Kubota，Hiroshi Ohno

通讯作者单位：日本RIKEN综合医学科学中心(IMS)

DOI号：10.1038/s41586-023-06466-x

实验设计

结果

本研究对306名受试者(男性占71%)进行了分析，年龄在20至75岁之间(中位年龄为61岁)，他们是在年度健康检查中招募。为了避免高血糖的长期影响，排除了被诊断为糖尿病的个体。因此，与大多数以前的糖尿病和肥胖宏基因组研究相比，本研究纳入了相对健康的个体；身体质量指数(BMI)和糖化血红蛋白(HbA1c)的中位数分别为24.9  kg  m⁻²(22.2-27.1  kg  m⁻²)和5.8%(5.5-6.1%)。本研究中分析的主要临床表型是胰岛素抵抗(IR)，其定义为IR的稳态模型评估(HOMA-IR)得分至少为2.5。本研究还分析了粪便代谢物与代谢综合症(MetS)之间的关联。除了血压和性别比例外，IR和MetS的临床特征在很大程度上重叠，IR和正常胰岛素敏感性(IS)个体之间没有差异(附表1)。使用两种基于质谱(MS)的分析平台进行非靶向代谢组学分析，鉴定出195和100种注释的粪便和血浆亲水性代谢物，以及2,654和635种注释的粪便和血浆脂质代谢物。为了确定微生物功能、粪便代谢物和预测基因的总体差异，分别总结了共丰度组(CAGs)和KEGG类别。使用CAGE方法获得了外周血单核细胞(PBMCs)的转录组信息，该方法可以在转录起始位点分辨率下测量基因表达。

为了研究粪便样本的组学数据如何预测IR，作者首先比较了基于随机森林分类器的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)。使用最小冗余最大相关算法从粪便16S、代谢组、宏基因组及其合并数据集中选择模型的预测变量(附表2)。本研究发现，粪便代谢组学数据的选择特征通常在预测IR方面优于16S和宏基因组(图1a)，这表明粪便代谢组学可以用于研究IR的发病机制。

图1.粪便碳水化合物代谢物在IR中发生明显变化。a，左侧：使用随机森林分类器的AUC值，基于属水平16S数据(n=282)、KEGG orthologue(KO)水平宏基因组数据(n=266)、粪便代谢组和宏基因组(KEGG orthologue)+粪便代谢组数据(n=266)来预测胰岛素抵抗(IR)。在x轴上，选择的特征标记数量逐渐增加。右侧，箱线图显示所选特征获得的AUC值。b，粪便亲水代谢物(hydroCAG，顶部)和脂质代谢物(lipidCAG，底部)以及临床表型和标志物(n=282)。左侧的双列热图表示使用基于排名的线性回归分析的主要临床表型(IR和MetS)的相关性，而主热图显示了根据年龄和性别调整后的部分Spearman相关性(pSC)与代表性代谢标志物。只有Padj < 0.05的CAGs着色。c，HOMA-IR和粪便单糖水平之间的pSC。描述了系数(pSC)和Padj值(n=282)。d，MetS中的粪便单糖水平(n=306)。

1.IR中粪便碳水化合物增加

接下来，寻找临床表型与粪便代谢物CAGs之间的关联(图1b和附表3-8)。在与临床标志物的相关性和回归分析中，调整了主要的混淆因素，即性别和年龄。在亲水性代谢物中，与IR显著相关的CAGs大多是碳水化合物代谢物，主要是单糖(亲水性CAGs 5、12和15；图1b，顶部)。已知作为碳水化合物发酵产物的短链脂肪酸(SCFAs)也在IR中增加(亲水性CAG 8)。亲水性CAG 18因包含不同途径的代谢产物而未被注释(附表5)。对这些与IR相关的亲水性CAG中的代谢物进行KEGG通路富集分析显示，这些代谢物确实参与碳水化合物代谢(扩展数据图2a)。具体而言，本研究发现主要的单糖如果糖、半乳糖、甘露糖和木糖与IR显著相关(图1c)。在SCFAs中，丙酸在IR中特别增加(扩展数据图2b)，与其在糖异生中的作用一致。粪便单糖在MetS、肥胖和糖尿病前期中也表现出类似的增加趋势(图1d和扩展数据图2c、2d)。相比之下，二糖显示出较弱关联或无关联(扩展数据图2b-d)。这些结果表明，碳水化合物降解的终产物(如单糖)容易被宿主吸收和利用，在IR和MetS患者的粪便中特别增加。为了支持这些发现，作者对以前发表的TwinsUK队列的粪便代谢组学数据进行分析显示，粪便单糖，尤其是葡萄糖和阿拉伯糖，与肥胖和HOMA-IR呈正相关，这两者都与IR相关(扩展数据图3a-c和附表9)。同样，HMP2数据显示，在没有炎症性肠病(IBD)的少数个体中，粪便果糖、葡萄糖和半乳糖的峰值强度与BMI相关(扩展数据图3d)。综上所述，这些结果表明，IR和相关病理与粪便中的碳水化合物增加有关，并且这种改变在不同人群中都能持续观察到。

除亲水性代谢物外，粪便脂质CAGs也与IR相关(图1b)。溶血磷脂、胆汁酸和酰基肉碱与IR和MetS相关，这与先前的报道相一致。其中，一个主要由双半乳糖/葡萄糖二酰基甘油(DGDG)(脂质CAG 11)组成的脂质CAG引起了作者的注意，因为据报道DGDG来源于细菌。这些脂质在其结构中含有葡萄糖和/或半乳糖，尽管它们在哺乳动物中的生物学功能大部分尚不清楚。这一类别中的大部分DGDGs与一些前体二酰基甘油和单糖(即葡萄糖和半乳糖)呈正相关(扩展数据图4a)。由于二酰基甘油在IR发病机制中起着重要作用，这类代谢产物的生物学功能尤为重要。值得注意的是，脂质CAG 41中具有不同酰基链的DGDGs与IR没有关联(附表7)，这意味着脂质酰基链的差异可能具有先前报道的生理重要性。

2.IR中的微生物-代谢物关系

接下来研究了与胰岛素抵抗(IR)相关的肠道微生物组的改变以及肠道微生物组的功能。肠道微生物群多样性在个体之间存在差异(扩展数据图5a-e)。然后，使用16S rRNA测序数据对研究参与者的属水平微生物组成进行了分析，并鉴定出了四个细菌群(扩展数据图5f)。第一组以毛螺菌科(如Blautia和Dorea)为主，而第二组以拟杆菌目(如Bacteroides、Parabacteroides和Alistipes)和Faecalibacterium为特征。第三组包含放线菌门的属。第四组没有形成明显的网络。可以根据其分类学特征将研究参与者进一步划分为四个簇，从A到D(图2a)。簇C中的个体明显含有第二组细菌，即Bacteroidales，而簇D中的个体显示出第一组和第三组细菌的丰度较高(扩展数据图5g)。值得注意的是，簇C中IR的比例(图2a；P=0.0071)明显较低。与IR和MetS相关的其他代谢参数，如HOMA-IR、BMI、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和脂联素，在簇C(IR比例最低)和其他三个簇之间也存在差异(图2b和附表10)。根据鸟枪宏基因组数据发现，在具有丰富的第一组和第三组细菌的个体中，IR的比例始终高于具有丰富的第一组细菌的个体(扩展数据图5h)。HOMA-IR与Rikenellaceae科的Alistipes以及Bacteroides、Bifidobacterium和Ruminococcus属中的一些物种呈负相关(扩展数据图5i和附表11、12)，在某种程度上重复了先前关于肥胖个体的报道。值得注意的是，不同的属和物种与其他临床标志物相关，这表明微生物分类群与临床表现之间的个体关联不如共丰度分析中稳健。

接下来，基于显著的正相关或负相关关系构建了一个微生物-代谢物网络(附表13)。尽管粪便SCFAs和脂质(如DGDG)与IR-和IS-相关的细菌群都有相关性，但与IR相关的粪便碳水化合物主要与第1组和第4组的菌属相关，最显著的是毛螺菌科的Dorea(图2c,d)。相比之下，这些碳水化合物中的大多数与第2组细菌中的Bacteroides、Alistipes和Flavonifractor等IS相关属呈负相关(图2d和扩展数据图5j)，与第1组细菌的相关性较小。因此，粪便碳水化合物水平在参与者簇之间明显不同(扩展数据图5k)。先前的研究表明，一些毛螺菌科物种参与多糖发酵，而Alistipes在动物性饮食而不是富含多糖的饮食中增加。这些发现强调了碳水化合物降解产物与IR和IS相关细菌之间的紧密联系，表明这些细菌可能与IR患者粪便碳水化合物谱的异常有关。

与IR相关的粪便碳水化合物还与碳水化合物代谢和转运相关的KEGG通路相关，如磷酸转移酶系统(PTS)、淀粉和蔗糖代谢以及半乳糖代谢，而与碳水化合物分解代谢相关的通路负相关，如糖酵解和丙酮酸代谢(图2e和附表14、15)。这些通路还与图2a中定义的参与者簇和图2d中定义的与碳水化合物相关的属明显相关。氨基酸代谢也存在差异，尤其是在簇C和D之间，而脂质代谢与微生物群没有明显关联(扩展数据图6a,b和附表16)。虽然碳水化合物通路(如PTS和淀粉与蔗糖代谢)与HbA1c和γ-GTP呈强正相关，但与其他IR标志物的关联通常较少(扩展数据图6c和附表17)，这表明代谢物对临床表现更为敏感，如图1a所示。PTS是细菌将糖分为能源来源的重要组成部分。KEGG orthologues的详细分析显示，粪便碳水化合物和参与者簇主要与二糖和氨基糖相关的PTSs相关(扩展数据图6d,e和附表18)，表明微生物群落通过PTS对糖的利用偏好可能会影响代谢物水平。糖苷酶催化寡糖和二糖分解，它们也与粪便单糖相关(扩展数据图6f)。细胞外葡萄糖苷酶，如β-果糖苷酶(KEGG Orthology数据库中的K01193)、淀粉蔗糖酶(KEGG Orthology数据库中的K05341)和低聚-1,6-葡萄糖苷酶(KEGG Orthology数据库中的K01182)，被预测可以将蔗糖和糊精降解为葡萄糖和果糖(扩展数据图6g,h)，显示出最高的正相关性，特别是与粪便葡萄糖。相比之下，与淀粉利用相关的葡萄糖苷酶，如α-淀粉酶(K01176和K07405)，与粪便碳水化合物呈负相关。重要的是，这些糖苷酶基因的丰度在参与者簇C和其他三个簇之间存在显著差异，表明分类学特征在很大程度上解释了糖苷酶的变化(图2f、扩展数据图6h和附表18)。一致地，与在簇C中丰富的Bacteroidales相比，在簇D中丰富的Blautia和Dorea的基因组中主要保守了双糖分解基因，而在簇C中几乎没有这些基因(扩展数据图6i)。综上所述，本研究揭示了具有独特分类学特征和碳水化合物代谢特征的四个不同人群，其特征包括糖的利用和降解，这与IR及其相关标志物相关。

图2.IR相关的粪便代谢物与肠道微生物群和微生物遗传功能的改变有关。a，属水平细菌的共丰度聚类及其丰度(n=282)。参与者根据其分类学特征被分为A至D四个簇。显示了IR患者的比例。b，参与者簇中的HOMA-IR、BMI、三酰甘油(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。c，共现微生物群与粪便代谢物(n=282)之间的细菌-代谢物网络。包括所有粪便亲水性和与细菌相关的脂质代谢物。仅显示正向且显著(Padj < 0.05)的Spearman相关性。与图1b中的碳水化合物有关的CAGs中的代谢物以红色突出显示。Unclust.表示未聚类。d，菌属与粪便碳水化合物之间显著正相关和负相关的数量。显示了每个相关性中排名前五的属。e，与碳水化合物代谢和膜转运相关的KEGG通路、粪便碳水化合物、与粪便碳水化合物正相关或负相关的前三个属以及参与者簇。f，参与者簇中参与糖苷酶的代表性KEGG orthologues的丰度(n=266)。丰度经过平方根反正弦转换。

3.粪便碳水化合物与IR中的炎症

与先前的报告一致，宿主细胞因子、代谢组学和转录组学特征与胰岛素抵抗(IR)高度相关(附表19-21)。此外，许多这些PBMC基因在炎症中发挥功能(扩展数据图7a)，可能来自单核细胞(附表21)。一些研究表明，微生物组分(如脂多糖)在促进代谢性疾病的炎症中起作用。然而，微生物代谢是否与低度炎症有关尚不清楚。因此，作者试图推断IR宿主炎症特征与粪便碳水化合物之间可能存在的关联。首先，与IR相关的个体代谢物、细菌、转录物和细胞因子的跨组学相关性网络显示，粪便碳水化合物与细菌和宿主IR相关特征密切相关，尤其是细胞因子，这表明这些代谢物是IR中宿主-微生物网络的核心(图3a、扩展数据图7b,c和附表22)。差异丰度，计算为其在IR和IS中的丰度比，在粪便碳水化合物与细胞因子之间的关联中最为显著。值得注意的是，血浆细胞因子IL-10与粪便碳水化合物的关联最为显著，而与PBMC衍生转录本轻微相关，这支持了最近的研究，即IL-10促进IR的悖论效应。粪便碳水化合物适度解释了IL-10的变化，并在较小程度上解释了脂联素、瘦素和Serpin E1的变化，表明粪便碳水化合物与这些细胞因子特别相关(图3b)。虽然粪便碳水化合物解释的方差比例低于血浆代谢物，但远高于属水平丰度解释的方差，突显了粪便代谢物在肠道微生物群和宿主炎症反应之间的作用。接下来，作者试图通过因果中介分析来推断这些细胞因子是否介导了粪便碳水化合物对宿主代谢的影响。结果发现，IL-10、Serpin E1、脂联素和瘦素介导了粪便碳水化合物与宿主IR标志物(如HOMA-IR)之间的大多数因果关系(图3c、扩展数据图7d和附表23)。值得注意的是，代谢物与细胞因子之间存在独特的对应关系；例如，IL-10介导了果糖、甘露糖、木糖和鼠李糖的作用，但对其他代谢物没有这种效应。尽管这些独特对应关系的生物学重要性尚待进一步研究，但对IR中粪便微生物组、代谢组和宿主炎症表型的综合分析表明，过多的单糖可能会影响宿主细胞因子表达。

图3.粪便碳水化合物代谢物与IR中的细胞因子水平相关。a，基于IS(Insulin Sensitive，胰岛素敏感)、中等(即，HOMA-IR >1.6且<2.5)和IR(Insulin Resistant，胰岛素抵抗)样本的所有组学信息(n=46、70和275)，构建了粪便碳水化合物代谢物(紫色)、粪便细菌(绿色)、血浆亲水性代谢物(粉色)、细胞因子(黄色)和PBMC基因(红色)之间的网络。分析包括与IR显著相关的宿主衍生标志物(见补充表19–21)，图1b和扩展数据图5f中分别鉴定的15种粪便碳水化合物和20个属。为构建组学网络，计算了根据年龄、性别、BMI和FBG调整的配对pSC，并显示了P_adj < 0.05的相互作用。线的宽度表示系数的绝对值，红色和灰色线分别表示正相关和负相关。b，使用随机森林分类器预测每个组学数据集预测的10种血浆细胞因子的解释方差。c，冲积图显示了血浆细胞因子显著介导了粪便碳水化合物对宿主代谢标志物的silico效应。线显示了中介效应，颜色表示由单个细胞因子介导的关联。

4.实验模型中的IS相关细菌

上述人类多组学分析结果显示了碳水化合物代谢物与IR病理之间的关联。为了探讨肠道微生物、粪便碳水化合物与代谢性疾病之间的因果关系，本研究首先分析了22种人类粪便IS和IR相关细菌的细菌培养物中的代谢物。这些细菌是根据属水平共现(图2a、b)和种水平(扩展数据图5i)的特征选择的。198种代谢物的主成分分析图表明，拟杆菌目(代表性的IS相关细菌目)沿PC1显示出独特的代谢谱(扩展数据图8a,b和附表24)。导致组别分离的前10种代谢物包括几种氨基酸和发酵产物，如琥珀酸和富马酸盐，其中大多数代谢物是由拟杆菌优先产生的(扩展数据图8b,c)。在细菌培养物中检测到了与IR相关的15种碳水化合物中的13种(图1b)(扩展数据图8b)。这些碳水化合物中的大多数沿着PC1呈负向分布，表明这些代谢物与Bacteroidales呈负相关。与其他目相比，拟杆菌目优先消耗葡萄糖、甘露糖和葡萄糖胺，而乳果糖主要由Eubacteriales产生(扩展数据图8d)。Alistipes indistinctus在消耗多种碳水化合物方面表现最为强劲(扩展数据图8e,f)。这些结果表明，拟杆菌目物种是多种碳水化合物的有力消费者，推动了其发酵产物的产生。

接下来，作者测试了在人类队列研究中显示与IS相关的七种候选细菌的潜在治疗效果。在饲喂高脂饮食的小鼠中，A. indistinctus、Alistipes finegoldii和Bacteroides thetaiotaomicron的给药明显降低了餐后血糖水平(图4a)。胰岛素耐受试验还显示这些菌株改善了胰岛素抵抗，尤其是A. indistinctus的给药效果最显著(图4b,c)。A. indistinctus给药改善了体重增加、肝脏甘油三酯异位积累和葡萄糖不耐受(扩展数据图9a-d)。接受A. indistinctus治疗的小鼠血清HDL-C、脂联素和甘油三酯水平也有所改善(扩展数据图9e-g)。hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp分析结果表明，A. indistinctus给药明显改善了胰岛素抵抗，尤其是全身葡萄糖处理(扩展数据图9h-j)。A. indistinctus和A. finegoldii处理小鼠的肝脏和附睾脂肪中AKT磷酸化水平升高(扩展数据图9k,l)，表明肝脏和脂肪组织中的胰岛素信号通路得到改善。这些发现揭示了A. indistinctus给药在改善饮食引起的肥胖和胰岛素抵抗方面的潜力。

在机制上，代谢测量结果显示，A. indistinctus治疗的小鼠中碳水化合物氧化显著降低，这意味着碳水化合物的使用受到限制(扩展数据图9m和附表25)。由于膳食摄入和运动活动保持不变(扩展数据图9n、o)，作者推断A. indistinctus治疗减少了肠道中的宿主可利用碳水化合物。在这方面，A. indistinctus治疗显著改变了盲肠代谢物的特征，主要表现为几种碳水化合物的减少，包括果糖(扩展数据图10a-c和附表26)。血清中的果糖也同样减少(扩展数据图10d)。重要的是，胰岛素耐量试验的AUC与盲肠单糖果糖、葡萄糖和甘露糖呈正相关(图4d)。综上所述，这些结果表明A. indistinctus改善了IR并影响了小鼠肠道碳水化合物代谢，支持了我们在人类队列研究中的观察结果。

图4.在实验模型中，IS相关细菌改善了IR。a，饲喂高脂饮食的小鼠在细菌给药后4周的餐后血糖。n=12(对照组)，n=10(A. indistinctus和A. finegoldii组)，n=5(其他组)只小鼠。b和c，胰岛素耐量试验期间的血糖水平(b)和AUC(c)(每组n=5)。d，胰岛素耐量试验的AUC与A. indistinctus(蓝色)或对照(灰色)组盲肠中果糖、葡萄糖和甘露糖水平之间的相关性。

讨论

为了深入了解IR中宿主与微生物的关系，本研究使用多模态技术进行了一项全面而广泛的研究，探讨了肠道微生物组与人类代谢性疾病之间的相互作用。尽管肠道微生物的碳水化合物代谢已被认为会影响肥胖和糖尿病前期的发病机制，但由于缺乏详细的代谢组学信息，在人类中实际的机制联系尚不明确。在这方面，本研究方法的主要优势在于将超过2,800种已注释代谢物的粪便代谢组学与微生物组和宿主病理相结合。这种基于代谢组的方法使我们能够识别与IR相关的粪便代谢物，确定粪便碳水化合物与IR低度炎症之间的关联，并在实验设置中高效地选择候选菌株进行功能验证(扩展数据图10e)。总的来说，本研究强调了综合组学策略在探索微生物代谢及其产物在IR发病机制中的作用方面的优势。过量的单糖有可能促进异位脂质积累，同时也激活免疫细胞，导致低度炎症和IR。果糖因其在脂质积累中的作用而被广泛认为是炎症和IR的风险因素，而半乳糖已被证明参与激活免疫细胞的能量代谢。本文的体内研究证实，A. indistinctus给药改善了脂质积累，从而改善了IR，同时降低了肠道单糖水平(图4d)。然而，作者意识到需要进一步的机制研究来检查吸收动力学及其对宿主代谢的影响。特别是，Alistipes菌株如何抑制碳水化合物代谢是一个有趣的问题(例如，这些细菌本身是否抑制碳水化合物代谢，或者它们是否与其他共生菌相互作用)，因为这将直接为新的治疗策略打开可能性。鉴于A. indistinctus改善了全身IS(扩展数据图9i)，研究肝脏以及外周组织(包括骨骼肌和脂肪组织)中的胰岛素信号通路的参与，以及这些组织中特定脂质分子(如神经酰胺和二酰基甘油)的积累具有重要意义。这些调查有可能揭示A. indistinctus改善IR的潜在机制。最后，人类研究中有两名参与者无法在早上收集粪便，这可能会影响结果，因为对时间和禁食条件的控制不足。因此，作者认为有必要进行纵向研究，包括及时记录饮食习惯，以解析微生物代谢对糖尿病及其并发症发展轨迹的复杂影响，同时考虑潜在的混杂因素。