|
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。
多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。 研究细胞的增殖与存活，也算得上是许多实验室的日常。细胞长快了还是长慢了，变多了还是变少了，是一项非常直观的功能指标。其中，数细胞当然是最直接的方法。然而，有时候因条件限制，或者实验设计的特殊性，直接进行细胞计数可能会变得相当麻烦。这时候，我们就要学会选择其他的方法。这篇文章将给各位概述目前常用的研究手段，并分别讲解其中的优劣。 
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。1. 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。注意：细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000-10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。2. 将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。3. 将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，原则上细胞贴壁后即可加药。一般5-7个梯度,每孔100ul，设3-5个复孔。注意：对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度，尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)，再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。4. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。5.每孔加入10ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
制作标准曲线
制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴) ，O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致)。
计算公式
细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ；
Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；
Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。
计算IC50 改良寇式法：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)CCK-8是近年新开发的一种更新的水溶性四唑盐检测，原理与WST-1类似：在电子载体1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物（Formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量，在一定细胞数量范围内甲臜形成的量与细胞数成正比。 实验步骤 1. 在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。4. 向每孔加入10μL CCK溶液应注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。7. 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
参考MTT实验分析结果。 克隆形成试验是测定细胞增殖能力的有效方法之一，贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量，可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 实验步骤 1. 取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的细胞生长培养基中备用。2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。3. 置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。4. 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。5. 加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。6. 去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟。8. 将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。9. 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。实验步骤 1. 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。2. 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。3. 按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。4. 按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。5. 把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。
用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。. 细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量 (如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定)，从而判断细胞的增殖能力。 实验步骤 1. 细胞以1.5×105 /ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片)，培养1 d，用含0.4%FBS培养液同步化3 d，使绝大多数细胞处于G0期。2. 加入BrdU(储液：1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml)，37℃，孵育40min。5. 经固定的玻片空气干燥，0.3%H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。8. 冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1：50)，阴性对照加PBS或血清。9. 按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数(LI)。1. BrdU配制方法：10 mg溶于10 ml双蒸水，4℃下避光保存。2. BrdU会肌体造成不可逆损伤，使用时注意安全，避免吸入BrdU粉尘。
EdU细胞增殖检测方法不需要剧烈的DNA变性操作，只需温和的细胞固定化和透化处理，能够较好地保护细胞形态、DNA整体结构及细胞内抗原识别位点，更适合结合其他染料或蛋白标记（如P65抗体）等进行多重标记，从而在细胞水平获取更多的直观多维特征信息，更适合深入开展细胞功能方面的研究。该方法无需DNA变性，无需抗原修复，无需抗原抗体反应，简单、灵敏、快速、准确，适合各种细胞系的细胞增殖检测，尤其适用于各种细胞系的高通量筛选实验，如在药物筛选中检测加药后细胞增殖变化。 实验步骤 （BeyoClick™ EdU-555细胞增殖检测试剂盒） 1. 在6孔板中(如有必要可以加入盖玻片)培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理等。
配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是与培养液等体积加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推荐的EdU终浓度为10μM (1X)，用细胞培养液1:500稀释EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
2. 将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。例如设计终浓度为10μM，原先6孔板中的培养基为1ml，则将1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培养基体积过大，可以先吸除适量的培养液，再加入等体积的2X的EdU工作液；或者可以减少工作液的体积并增加EdU的浓度，使最终培养液中的EdU浓度为10μM，例如2ml培养液中加入220微升0.1mM EdU。更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议替换所有的培养液。
3. 继续孵育细胞2小时。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期大约在18-25小时，孵育时间宜在2小时左右。人胚胎细胞的细胞周期约30分钟，推荐的孵育时间为5分钟；酵母细胞的细胞周期约3小时，推荐的孵育时间为20分钟，增殖的神经细胞其细胞周期约5天，推荐的孵育时间为1天。孵育时间小于45分钟时，建议提高EdU的浓度；孵育时间大于20小时时，建议适当降低EdU的浓度。
4. EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml固定液，室温固定15分钟。注：对于流式细胞仪检测，贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定。
5. 去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。
6. 去除洗涤液，每孔用1ml通透液，室温孵育10-15分钟。
7. 去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。8. 配制Click Additive Solution：对于C0075S，用1.3ml去离子水溶解一管Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution；对于C0075L，加入10.4ml去离子水溶解试剂盒中提供的一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution。配制后可以适当分装，并-20℃保存。
9. 参考下表配制Click反应液。注意：请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行；同时，Click反应液须在配制后15分钟内使用。
11. 每孔加入0.5ml Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。
13. 吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
14. 吸除洗涤液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室温避光孵育10分钟。
15. 吸除1X Hoechst 33342溶液。
通过以上介绍，相信大家对细胞增殖的检测方法有了比较系统的认识，在具体实验中，只需要根据具体的实验目的和细胞类型选择最佳的实验方案。
|
