|
EdU，就是胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷，thymidine)类似物，就是T的类似物，可以与T竞争到DNA的合成过程中（A=T，C=G），从而被相应的设备检测到，反应细胞的增殖情况。 检测细胞增殖， EdU法比BrdU方法更好。 BrdU法步骤繁多，且需要使用BrdU抗体，影响因素较多，稳定性比较差。并且由于BrdU法需要使用抗体，有时会和其它目的蛋白基于抗体的检测相互产生干扰。EdU法是一种在BrdU法基础上升级换代的新方法，将会逐步取代BrdU法。 EdU细胞增殖检测试剂盒，可以检测到细胞或组织样品中单个的增殖细胞，很多方法都无法检测到单个的增殖细胞（比如CCK-8法）。 https://blog.sina.com.cn/s/blog_80ec9c840100rl74.html 荧光显微镜检测方法（以96孔板，肺癌A549贴壁细胞为例） 取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。 1.1 用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液 (试剂A)，制备适量50μM EdU培养基； 注：1）如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例； 2）配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质，如LB培养基 4℃ 可稳定保存两周。1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；2）最佳孵育时间与细胞周期相关（表2 在哪里？），大多数细胞系可采用2小时孵育时间；3）EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<30min）宜采用高浓度（50 μM），长时间孵育（>24h）宜采用低浓度（1 μM），最佳孵育浓度需要优化。注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。 2.1 每孔加入100μL 细胞固定液 (即含4% 多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟；注：1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体染料进入细胞内。2.2 每孔加入2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；注：作用是中和多聚甲醛，当采用其他方式进行细胞固定时可省略此步骤；2.3 每孔加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；2.4 （加强）每孔加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。注：当实验需要进行其他抗体染色，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。 3.1 每孔加入100 μL的1X Apollo®染色反应液（表3在哪里？），避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；注：染色液用量与细胞培养体积相关，以覆盖细胞为宜（表1在哪里？）。3.2 加入100 μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS) 脱色摇床清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂；3.3 （加强）每孔每次加入100 μL 甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。 4.1 用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1X Hoechst33342反应液，避光保存；4.2 每孔加入100 μL 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；4.3 每孔每次加入100 μL PBS清洗1~3次；4.4 客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入100 μL PBS保存待用。 染色完成后，建议立即进行观测；如果条件限制，请避光 4℃ 湿润保存待测，但不应超过3天。注：调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要>1s。
https://blog.sina.cn/dpool/blog/s/blog_80ec9c840100rl74.html 
对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞，推荐EdU的使用终浓度为10μM。但细胞类型、培养液种类、细胞密度、细胞增殖速度等多方面的因素会影响EdU掺入到细胞中的量，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索。 碧云天说明书： https://www./mobilegoods.do?method=code&code=C0085S 将37ºC预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议替换所有的培养液。 加入EdU工作液，继续孵育细胞2小时。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。对于常见的哺乳动物细胞，汝HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期大约在18-25小时，孵育时间宜在2小时左右。人胚胎细胞的细胞周期约30分钟，推荐的孵育时间为5分钟；酵母细胞的细胞周期约3小时，推荐的孵育时间为20分钟，增殖的神经细胞其细胞周期约5天，推荐的孵育时间为1天。孵育时间小于45分钟时，建议提高EdU的浓度；孵育时间大于20小时时，建议适当降低EdU的浓度。 找不到了。
《暴走大事件 第6季》第5期：总结2018感谢陪伴，2019再出发！ 《暴走大事件 第6季》第10期：古装剧平行宇宙大乱斗 宋朝帝王群聊（1）：赵构面见北宋众帝，一人给一拳！ 
|
