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我们在做免疫荧光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡检测（TUNEL）时，免不了要制备细胞爬片，爬片质量完全决定了最后拍照的质量以及实验数据的精准性。今天，医学方小编就教大家如何制备好的细胞爬片。
爬片的准备 1 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用细胞爬片（价格比较昂贵）但是细胞贴壁牢固，拍出照片效果好； 2 可根据自己的需要，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色剪裁成合适大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；
细胞爬片（以常用24孔板为例） 1 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。 2 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作，玻片是无菌处理的，可以酒精灯外火焰附近做。
3 根据自己的需要，选择合适的细胞密度（细胞太密影响拍照效果），将计数分好的细胞混匀后铺到孔中，种入24孔板一个孔内即可。 4 待细胞贴壁后，可去上清加处理组培养基。 5 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，小编会将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。
如果要做诸如24h，48h，72h等不同时间点实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。 爬片细胞的固定处理 以下为常用的固定液： 1 冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。 将纯丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10min。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。 2 多聚甲醛(常用4%)：避光保存，可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 室温固定15-30min后，将表面液体吹干， -20℃保存 3 95％乙醇，可用于免疫组化。 优点：穿透性强、抗原性保存较好。 缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，孵育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。室温固定15min后，将表面液体吹干，入-20℃保存 4 甲醛 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 小编将以多聚甲醛为例，讲讲24孔板内，细胞爬片固定步骤： 1 准备多聚甲醛（PFA）： 4℃冰箱保存。 2 将细胞从37℃培养箱取出，用预温的PBS洗3遍，每次加入1ml PBS，轻轻晃动，避免将细胞冲掉。 3 注意爬片的细胞面向上，每孔用4℃的多聚甲醛500ul即可，室温固定30-40min，避光。 4 固定后，用PBS洗三次。 5 0.2-0.5%Triton X-100透化10-20min，覆盖细胞即可。 6 PBS洗三次。 如果是做免疫荧光 7 后续用3%的BSA，用PBS配置，封闭1h。 8 封闭后，用PBS洗三遍，按比例加入一抗，4℃过夜，若转入荧光标签的质粒，要避光。 9 过夜后，用预温的PBS洗细胞，动作轻缓，可多洗一会儿，可以用慢摇床摇。 10 加入用3%BSA稀释的二抗，室温孵育1h，避光。 11 孵育结束后，避光用PBS洗3次，动作轻缓，可以多洗一会儿。 12 1ug/mL DAPI ，室温避光，染细胞核DNA 20min。 13 PBS洗三次。 细胞爬片封片 1 将载玻片洗好在干净无尘纸上晾干 。 2 将PBS中的细胞取出，注意细胞面朝下，载玻片上滴入亮甲油，或者防防猝灭封片剂，盖在载玻片上（市面上可以买到封片防猝灭剂）。
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后做固定。根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡TUNEL染色时就避免洗，凋亡细胞在洗的过程中可能会脱落。
保存细胞爬片时，一般用培养皿或避光湿盒，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照没有问题的。制备好的细胞爬片是不是很简单呢？ |
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