1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的培养皿里,PBS洗三遍。
注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小,夹取的时候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加PBS不要太冲,不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟,PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟,PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜,也可37度2小时,感觉前者效果好,PBS洗三遍。
6. 二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时,PBS洗三遍。
7. 最好用DAPI染核,然后直接照荧光片。
8. 蒸馏水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因为甘油不象树脂那样会干,所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
建议:1.还是染完之后没有封片前直接照一些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。