【原】细胞盖玻片免疫组化protocol及小窍门

一、细胞爬片免疫组化技术路线          
1. 细胞爬片终止培养后，PBS洗2×2 min（PBS可以不灭菌），细胞载片用4%的多聚甲醛（室温）40 min—24 h，PBS漂洗，3×5min；          
2. 1% Triton X-100 孵育 1次（室温） 10 分钟，PBS漂洗，3×5 min；          
3. 用3%H₂O₂去离子水室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性；PBS漂洗，3×5 min；          
4. 滴加封闭用正常山羊血清工作液37℃孵育20 min，倾去，勿洗；          
5. 滴加一抗50μl，4℃冰箱过夜后，PBS冲洗，3分钟×3次；          
6. 滴加荧光二抗，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，3 min×3次；          
7. DAPI 10 min，PBS冲洗，3 min×3次。

         

二、注意事项

1. 倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，会省去盖玻片经常脱落麻烦。

2.可用20%-50%甘油封片，中性树胶封的不好容易“花片”。          
荧光不宜用中性树胶封片

3.关于固定液

（1）多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等

（2）乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解;染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度

（3）甲醛(福尔马林)应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

三、做细胞爬片小窍门（源自丁香园）

看师兄做细胞爬片，需要从培养孔中取出爬好的片子，多半用的是小镊子。造成的结果不是片子划的乱七八糟，就是不小心把片子弄断，突发一念，做了一个小工具。现推荐这个小窍门给大家，已经介绍给很多人，都在用，感觉很好。 取一个注射器针头，针头头部都会有一个斜面，把针尖背对斜面的一方弯曲成90度，记住只是针尖部位，形成一个小倒刺状。取爬片的时候把培养板放倾斜，可在板子下支一个东西，左手拿小镊子，右手拿针头。用针头头部弯好的倒刺，去勾爬片，很容易就会勾起来，而且不会伤片子。再用镊子把片子夹出来。速度比原来提高很多，取一个板子的爬片只要一分钟。说的不是很清楚 画张图给大家吧。