组织冰冻切片如何进行免疫荧光

                      

  

   观察组织中目的蛋白的定位，一般可以选择冰冻切片进行免疫荧光。冰冻切片制作时间短，操作过程简单快捷，同时获得的免疫荧光图片相对于免疫组化图更加漂亮。

     冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。用高分子材料配制成冰冻切片包埋液，将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘上加少许包埋液，在其固化前嵌入组织块，然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。

     冰冻切片过程较简单，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态。

    免疫荧光技术亦称荧光抗体技术，应用化学方法将荧光色素（主要是异硫氰酸荧光黄FITC）与抗体结合起来，即荧光抗体，这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变。在特定条件下用荧光抗体染标本，如果标本中存在有相应的抗原，荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合，在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下，标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光，荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在。免疫荧光特异性强、敏感性高、速度快。

今天就为大家介绍一下冰冻切片免疫荧光染色流程。

冰冻切片免疫荧光染色流程

1

    冰冻切片一般选择多聚赖氨酸黏附性载玻片，多聚赖氨酸处理载玻片是带强阳离子的,主要用于病理组织切片、液基细胞学涂片,作用是防止玻片掉片。冰冻切片之后如果不即时染色，可将片子放于负八十冰箱。再次取出后可先在室温晾干15分钟。然后置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；

2

    用组化油笔将待染组织圈好，目的是为了在进行后续孵育抗体时尽量缩小范围，使抗体进行有效的孵育；

3

    0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）;用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干）封闭的目的是通过血清与非特异性位点结合,以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低背景；

4

    加入一抗(1:100-1：500)，4℃孵育过夜。一抗的浓度可以使用抗体的推荐浓度，或可根据抗体的质量选择合适的浓度；

5

    PBS洗3次，每次10分钟；

6

    加入荧光标记的二抗(1:200)，37℃孵育1小时，此时注意要进行避光操作。常用的荧光素有FITC（呈现明亮的黄绿色荧光）、rhodamine（呈现明亮的橙红色荧光）；

7

    PBS洗3次，每次10分钟；

8

    用羊血清稀释DEPI（1：1000），避光孵育5min,目的是染细胞核，10分钟。除了DEPI进行细胞核染色外，也可以选用Hoechst染色，一般为蓝色荧光；

9

    PBS洗3次，每次10分钟；

10

    滴加防荧光淬灭剂之后进行封片，封片时有一个小窍门，即在载玻片的四周点指甲油，可以有效地黏结盖玻片与载玻片。封片结束后，通过荧光显微镜观察结果并拍照；

冰冻切片免疫荧光注意事项

（1）整个实验过程中勿使表面干燥。

（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。

（3）冰冻切片进行免疫荧光之后，需要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭。

（4）在进行荧光显微镜拍照时，要根据荧光抗体选择合适的激发光源。

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