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EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。  接下来我们以一种常用的EdU检测试剂盒为例，介绍一下实验步骤。 1、细胞培养 （1）细胞均匀种在6孔板里； （2）待细胞密度长到60-90%时，转染相应核酸； （3）转染后24小时，用胰蛋白酶把6孔板里的细胞消化下来，接种于48孔板中（每个样3个重复），培养至密度70%-90%； 2、EdU标记 （1）用细胞培养液按1000：1的比例稀释EdU溶液 (试剂A)，制备适量50 μM EdU培养基； EdU培养基及染色反应液的使用量参考 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 6 cm小皿 EdU培养基 100 μL 150 μL 200 μL 300 μL 500 μL 2 mL 染色反应液 100 μL 150 μL 200 μL 300 μL 500 μL 2 mL （2）每孔加入200 μL 50 μM EdU培养基孵育6 h，弃培养基； （3）200 μL PBS清洗细胞1~2次，每次5 min。 3、细胞固定化 （1）每孔加入100 μL 细胞固定液 (即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30 min，弃固定液； （2）每孔加入100 μL 2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育5 min后，弃甘氨酸溶液； （3）每孔加入200 μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；每孔加入200 μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10 min(加强)，PBS清洗1次，5 min。 4、Apollo染色 （1）每孔加入200 μL的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30 min后，弃染色反应液； Apollo®染色反应液的配置参考(现用现配) 配制顺序 Apollo®染色反应液 500μL 1 mL 5 mL 10 mL 1 去离子水 469 μL 938 μL 4.69 mL 9.38 mL 2 Apollo®反应缓冲液 (试剂B) 25 μL 50 μL 250 μL 500 μL 3 Apollo®催化剂溶液 (试剂C) 5 μL 10 μL 50 μL 100 μL 4 Apollo®荧光染料溶液 (试剂D) 1.5 μL 3 μL 15 μL 30 μL 5 Apollo®缓冲添加剂 (试剂E) 5 mg 9 mg 44 mg 88 g （2）加入200 μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS) 脱色摇床清洗2~3次，每次10 min，弃渗透剂； （3）(加强)每孔每次加入200 μL 甲醇清洗1~2次，每次5 min；PBS清洗1次，每次5 min； 5、DNA染色 （1）用去离子水按2500：1的比例稀释DAPI，制备适量1× DAPI反应液，避光保存； （2）每孔加入200 μL 1×DAPI反应液，避光、室温、脱色摇床孵育10 min后，弃染色反应液； （3）每孔每次加入200 μL PBS清洗1~3次； 6、图像获取及分析 染色完成后用荧光显微镜观察拍照。每个孔随机选取5个视野观察拍照。分别拍摄EdU和DAPI的图像，然后进行合并。用Image-Pro Plus(IPP) 6.0进行计数。   END 微信号 | QDMH 科研服务 |
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