发酵过程灭菌与除菌工艺方法简介

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发酵过程灭菌与除菌工艺方法简介

If you  can manage it, you can improve it

“能管理，才能提高”

导  读 

为了保证工业生产上纯种发酵的顺利进行，无菌控制显得尤为重要。如果在培养过程中污染杂菌，杂菌便会消耗营养，甚至分泌出抑制生产菌生长的代谢产物，从而干扰正常生产。因此，在生产菌种接种之前要对发酵培养基、发醉罐、管路系统及空气系统、环境等方面进行灭菌，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。保持发酵过程无杂菌污染，最重要的是建立发酵工业中的无菌操作技术。

基本概念

灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物(包括芽孢)永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌;

消毒：利用物理或化学方法杀死物体或环境中病原微生物的措施，并不一定能杀死含芽孢的细菌或非病原微生物;

除菌：利用过滤的方法去除环境中的微生物及其孢子;

防腐：利用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。

其中，消毒与灭菌的区别在于，消毒仅仅是杀灭生物体或非生物体表面的微生物，而灭菌是杀灭所有的生命体。因此，灭菌特别适合培养基等物料的无菌处理。

灭菌的必要性

在工业发酵生产中目前绝大多数都要求采用纯种发酵，即在发酵的全部过程中只能有生产菌，而不允许其他杂菌生长繁殖。若在培养过程中污染杂菌，杂菌便会在较短的时间内大量进行繁殖。

染菌的后果

• 与生产菌竞争吸收营养成分

• 分泌能抑制生产菌生长、抑制产物合成和严重改变培养液性质的毒副作用物质

• 产生某些酶类破坏代谢产物，严重损害工业发酵生产的正常进行

• 影响发酵液的过滤、提取，影响最终产品的质量及收率

• 发生噬菌体污染，生产菌种细胞被裂解而使生产失效

无菌操作

为了保证工业生产上纯种发酵的要求，必须在生产菌种接种之前对发酵培养基、发酵罐管道系统,空气系统及流加料等进行严格的灭菌，同时还要对环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。

发酵过程有害微生物控制方法

有害微生物的控制包括培养基灭菌、无菌空气的制备、发酵系统的密闭措施和生产环境的灭菌或消毒等多个方面的内容，需要采取合适的灭菌方法。灭菌方法有很多，可分为物理法和化学法两大类。物理法包括加热灭菌、辐射灭菌和介质过滤除菌法，化学法主要是利用化学物质灭菌。

可根据灭菌的对象和要求选用不同的方法，常用的无菌技术和方法主要有以下几种:

干热灭菌法

• 火焰灭菌法：利用火焰直接将微生物烧死，主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接种移液管和滴管外部及无用的污染物(如称量化学诱变剂的称量纸)等的灭菌，对金属小镊子、小刀、玻璃涂棒、载玻片、盖玻片灭菌时，应先将其浸泡在75%酒精溶液中，使用时从酒精溶液中取出来，迅速通过火焰，瞬间灼烧灭菌。该方法简单，灭菌彻底，但适用范围有限。

• 干热空气灭菌法：用高温干热空气灭菌的方法。该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿热气体穿透的油脂等方面的灭菌，不适合橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。在于热状态下，由于热穿透力较差,微生物的耐热性较强，必须长时间受高温的作用才能达到灭菌的目的。因此，于热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法高。为了保证灭菌效果，通常采用以下几种方式:135~140℃灭菌3~5h:160~170℃灭菌2~4h;180~200℃灭菌0.5~1h.

湿热灭菌法

• 湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法。由于蒸汽潜热大，具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会释放出大量热能，使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键(特别氢键)受到破坏，引起不可逆的变性，造成微生物死亡。

• 从灭菌的效果来看，干热灭菌不如湿热灭菌有效,干热灭菌温度每升高10℃时，灭菌速率常数仅增加2~3倍;而湿热灭菌对耐热芽孢的灭菌速率常数增加的倍数可达到8~10倍，对营养细胞则速率常数增加得更高(通常湿热灭菌条件为121℃，维持30min)。

• 湿热灭菌效率比干热灭菌法高且经济实惠，是生产上最常用的灭菌方法，已被广泛用于工业生产中大量培养基、设备、管路及阀门的灭菌。

• 影响湿热灭菌的主要因素有:微生物的种类与数量、蒸汽的性质和灭菌时间等。湿热灭菌法可分为：煮沸灭菌法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法、流通蒸汽灭菌法和间歇蒸汽灭菌法。

辐射灭菌法

X射线、r射线、a射线、β射线、紫外线(UV)、超声波、高能阴极射线等从理论上可以破坏蛋白质等生物活性物质，从而起到灭菌作用。但是由于其具体的杀菌机理还不是很明白，所以目前辐射灭菌中应用较广泛的射线还是以紫外线为主。紫外线波长为253.7~265nm时杀菌效力最强，它的杀菌力与紫外线的强度成正比，与距离的平方成反比。其杀菌机理是使DNA胸腺嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA正常复制此外，空气在紫外线辐射下产生的臭氧有一定杀菌作用。但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强，且紫外线的穿透力差，物料灭菌不彻底，因此只能用于物体表面、超净台以及养室等环境灭菌。本法特点是不升高产品温度，穿透力强，灭菌效率高;但设备费用较高对操作人员存在潜在危险性，能够使某些药物出现药效降低或产生毒性和发热物质等。

化学药剂灭菌法

大多数化学药剂在低浓度下起抑菌作用，高浓度下起杀菌作用。化学灭菌剂必须有挥发性，以便清除灭菌后材料上残余的药物。某些化试剂能与微生物发生反应而具有杀菌作用。常用的化学药剂有环氧乙烷、甲醛、5%石炭酥70%乙醇、高锰酸钾、乙二醇、漂白粉(或次氯酸钠)和季铵盐等。由于化学药剂可能会与培养基中的一些成分作用，且加人培养基后易残留在培养基内。所以，化学不能用于培养基的灭菌，一般用于发酵工厂环境的消毒。

过滤除菌法

过滤除菌法即利用过滤方法阻留微生物以达到除菌目的。此法仅适用于不耐高温的液体培养基组分和空气的过滤除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物的液体深层发酵使用。

小 结

为了保证工业生产上纯种发酵的要求，必须在生产菌种接种之前对发酵培养基、发酵罐管道系统、空气系统及流加料等进行严格的灭菌，同时还要对环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。保持发酵过程无杂菌污染，最重要的是建立发酵工业中的无菌操作技术。