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1.蛋白激酶在细胞周期调控的作用 1.1细胞融合实验 细胞周期的控制有两个主要事件，一个是对DNA复制起始的控制，发生在G1期和S期之间。第二个事件是染色体凝聚的控制，发生在G2期和M期间。 Rao和Johnson想知道在细胞质中是否含有影响细胞周期活性的调解因子，他们用处于细胞周期不同阶段的同步化的细胞进行融合，结果看到了不同的结果。首先他们将同步培养的G1期的HeLa细胞进行融合，其目的是想了解G1期的细胞中是否含有阻断S期细胞核中DNA复制的因子？还是在S期的细胞质中含有促进G1期细胞DNA复制的因子？他们发现，G1期的细胞质受到S期细胞质的激活，开始了DNA复制，这一实验结果表明，正在进行复制的细胞的细胞质含有促进G1期细胞进行DNA复制的起始因子。与此相反，他们将S期的细胞与G2期的细胞进行融合，发现G2期的细胞核不能再启动DNA的复制，这表明，S期的细胞质中的DNA复制起始因子对于进行了DNA复制的G2期的细胞核没有作用。 其他一些融合细胞实验得到了更有意义的结果。如将处于分裂期的细胞与处于细胞周期其他阶段的细胞融合，M期的细胞质总是能够诱导非有丝分裂的细胞中的染色质凝聚，将这种现象称为染色体超前凝聚（PCC），由于G1期、S期和G2期细胞中染色质的复制状态不同，PCC的结果也不相同，如与M期细胞融合的G1期的染色体为单线状，S期为粉末状，G2期染色体为双线。 这些研究结果表明处于M期的细胞中一定有种使染色体由松散状态凝聚成染色体的物质，即细胞周期调解因子的存在。 1.2促成熟因子的发现 促成熟因子（MFP）的活性在细胞周期中波动很大，在有丝分裂前急剧升高，但在优势分裂后又急剧下降，直到为零。 促成熟因子（MFP）是由两个不同的亚基组成的异质二聚体，一个是催化亚基，它能够将磷酸基团从ATP转移到特定底物的丝氨酸和苏氨酸残基上，这种蛋白激酶后来被称为细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）；另一个亚基称作细胞周期蛋白。 MPF蛋白激酶亚基不能单独起作用，它需要与细胞周期蛋白结合才有功能。之所以将另一个亚基称为细胞周期蛋白，是因为它们的浓度在细胞周期中是呈周期性变化的。同样，MPF的活性与细胞周期蛋白一样在细胞周期中呈现周期性变化。 当细胞周期蛋白的浓度降低时，蛋白激酶由于缺少与之结合的底物而失活。当细胞周期蛋白的浓度升高时，蛋白激酶被激活，促使细胞进入有丝分裂。这些结果表明：①细胞周期的进程依赖于一种酶的激活，而这种酶的唯一活性是使其他蛋白质磷酸化；②酶的活性受一种亚基的控制，它的浓度在细胞周期的不同阶段是不同的。 1.3遍在蛋白质介导的细胞周期蛋白的降解促使细胞退出有丝分裂 有3种细胞周期蛋白激发非洲爪蟾蜍卵母细胞的成熟：细胞周期蛋白A和两个结构相似的细胞周期蛋白B。通过对不同来源的编码细胞周期蛋白的cDNA序列分析发现，所有这些蛋白质的氨基酸序列中，靠近N端都有一个称作破坏框的同源区。 在细胞周期中，细胞周期蛋白在后期不久就开始降解，此时导致姐妹染色单体分开并被移向纺锤丝的两极。野生型的有丝分裂细胞周期蛋白结合之后，就有遍在蛋白质与之结合，然后通过遍在蛋白化作用将细胞周期蛋白进行标记以便蛋白酶体将周期蛋白迅速降解。 遍在蛋白质加到细胞周期蛋白上需要三种不同介导酶。首先，遍在蛋白质在它的羧基端通过与遍在蛋白活化酶（E1）的半胱氨酸残基形成硫酯键而被激活，然后，遍在蛋白质从E1转移到E2和第三种酶，遍在蛋白连接酶（E3）一起将遍在蛋白转移到细胞周期蛋白的赖氨酸残基上进行多遍在蛋白化；最后，被多变在蛋白化的细胞周期蛋白作为蛋白酶体的降解底物，被快速降解。E3通常是一种复合体，由多亚基组成。E3至少含有8个不同的亚基。触发有丝分裂细胞周期蛋白遍在蛋白化的E3又称为促后期复合物（APC）。APC激发E2-遍在蛋白复合物同有丝分裂细胞周期蛋白破坏框结合，然后激发遍在蛋白质同破坏框C端的赖氨酸残基结合，此过程不断循环使多遍在蛋白化。通过基因操作构建了不含破坏框的细胞周期蛋白，这些蛋白质不会被降解。 1.4 促后期复合（APC）的活性调解控制细胞周期蛋白B的降解 有丝分裂后期，细胞周期蛋白B的降解是通过对APC活性的控制进行调解的。从阻断在中期的非洲爪蟾卵细胞中分离的APC对于激发细胞周期蛋白B的多遍在蛋白化的活性很低。相反，从具有正常细胞周期的非洲爪蟾的卵细胞中分离的APC具有较高的激发多遍在蛋白化的活性。分析表明具有较高活性的APC复合物中有几个亚基是被磷酸化的；用磷酸酶除去APC中磷酸化位点的磷酸基团，会降低APC活性。 当MFP的活性在有丝分裂中期达到最高峰时，它将APC磷酸化并将其激活，按着发生细胞周期蛋白B多遍在蛋白化作用，引起细胞周期蛋白B的降解。由于细胞周期蛋白B是MPF的一个必需亚基，它的降解势必导致MPF失活。在G1期的后期，APC失活，使得细胞周期蛋白B的浓度升高，同时提高MPF的活性，以便进入下一个有丝分裂期。由于细胞周期蛋白B在整个细胞周期中是连续合成的，这就合理解释了在细胞周期中细胞周期蛋白B的浓度在分裂间期不断升高，而在有丝分裂期又突然下降。 1.5真核生物细胞周期调控的一般模型 该模型总结了控制细胞周期散了主要的CDK复合物的作用，这三种复合物分别是：G1期、S期和有丝分裂CDK复合物。当细胞被激活进入细胞周期时，首先是G1CDK 复合物进行表达。准备进入S期的细胞通过激活转录因子，引起DNA复制所需酶类以及编码S期CDK复合物的基因表达。S期CDK的活性开始被一种特异抑制物所抑制，而在G1期的后期，G1CDK 复合物诱导S期CDK抑制物的降解，释放出有活性的S期CDK复合物。 活性S期CDK复合物通过将DNA预复制复合物中蛋白质的调节位点磷酸化，将DNA预复制复合物激活。这些被S期CDK复合物磷酸化的蛋白质不仅能够激活DNA复制起始，还能够阻止新的预复制复合物的装配，从而保证了每条染色体在细胞周期中只复制一次，进而保证了每个子细胞中的染色体数的稳定。 有丝分裂CDK复合物是在S期和G2期合成的，但是它们的活性一直受到抑制直到DNA合成完毕。一旦被激活，有丝分裂CDK复合物就会诱导染色体凝聚、核膜解体、有丝分裂器的装配以及凝聚的染色体在中期的赤道板上排列。在所有凝聚的染色体都与适当的纺锤体微管结合之后，有丝分裂CDK复合物激活后期启动复合物。这种多蛋白的复合物指导后期抑制物通过遍在蛋白介导的蛋白酶解作用进行降解，导致在中期将姐妹染色体结合在一起的蛋白复合物失活。因此这些抑制物的降解作用，允许有丝分裂进入后期。在此期间，姐妹染色单体分开分别进入有丝分裂的两极。在后期末，APC也可诱导有丝分裂细胞周期蛋白的蛋白酶体的降解。有丝分裂CDK活性降低，使得分裂的姐妹染色单体去凝聚、核膜重新形成、胞质分裂、最后形成子细胞。 在下一个细胞周期的G1期早期，磷酸酶将那些预复制复合物的蛋白质去磷酸化，这样，这些蛋白质就可以在DNA复制区装配成复制复合物，准备进入S期。G1期CDK复合物在G1期后期将APC复合物中的Cdh1磷酸化并使之失活，这样使得有丝分裂周期蛋白在S期和G2期得以逐步积累。 细胞周期中3个关键的过渡，即G1期→S期、中期→后期、后期→末期及胞质分裂期，这些过渡都是通过触发蛋白质的降解进行的，所以是不可逆转的，这样迫使细胞周期只能沿一个方向进行。 在高等生物中，细胞周期的调控主要是调解G1期CDK复合物的合成和活性，G1期CDK复合物的活性受催化亚基特异位点的磷酸化状态的调节。称之为促分裂原的细胞外生长因子能够诱导G1期CDK复合物的合成和激活，一旦促分裂原作用了一定的时间，使细胞通过了晚G1期的某一点，即使将促分裂原除去，细胞也会继续完成有丝分裂。晚G1期的细胞分裂控制点被称为限制点。 2.裂殖酵母的细胞周期控制 2.1酵母的细胞周期基因突变 酵母中与细胞周期相关基因的突变很容易被识别：如细胞的温度敏感突变，如果是非允许范围内的温度突变，就会影响细胞的长度。已经分离出与细胞周期相关的温度敏感突变类型，可分为两类：一类是cdc突变，这类突变在非允许的温度下培养，会滞留在细胞周期的某个阶段，结果会形成特别长的细胞；因为这类突变不能进入有丝分裂期，滞留在间期，所以能够继续生长。另一类称为wee突变，这类突变长得特别小。 2.2裂殖酵母的MPF 一般来说，隐性表型是因为缺少野生型的功能蛋白所致，而显性表型是因为增加了一些功能蛋白，导致调节失常。 对分离cdc2-突变体的研究发现，该突变体没有Cdc2蛋白活性，细胞不能进入有丝分裂，表明Cdc2蛋白是裂殖酵母进入有丝分裂的一个关键调节因子。通过基因工程克隆了cdc2-基因，序列分析表明该基因编码一个分子质量为34KDa的蛋白，该蛋白有称为P34cdc2. 后来在裂殖酵母中分离了另一个cdc基因，命名为cdc13+,该基因的产物Cdc13蛋白也是裂殖酵母进入有丝分裂必需的。序列分析表明该基因编码的蛋白质与非洲爪蟾和海胆的周期蛋白B同源。后来还揭示Cdc13蛋白和Cdc2蛋白能够形成异质二聚体，并且具有蛋白激酶的活性。 2.3裂殖酵母的MPF活性调节 通过对一些cdc和wee突变体的研究，发现裂殖酵母的MPF的活性受其他一些基因编码产物的影响。如温度敏感突变体cdc25-在非允许的温度下也不能进行有丝分裂；另一方面，Cdc25蛋白的超表达，将会缩短G2期，使未成熟的酵母提前进入有丝分裂期。另一种突变体weel-也会造成酵母体积不够大就提前进入有丝分裂 ，而Weel蛋白的过量表达则延长G2期，形成长的酵母细胞。根据这些发现，推测Cdc25蛋白激活裂殖酵母的MPF的活性，而Weel蛋白抑制裂殖酵母的MPF的活性。 Cdc2蛋白亚基上有两个磷酸化位点，一个是激活型的磷酸化位点，另一个是抑制型磷酸化位点。独立存在的Cdc2蛋白激酶是无活性的，同周期蛋白Cdc13结合后，仍然没有活性。但此时的复合物成为两种蛋白激酶的底物，一种是weel激酶，它使Cdc2亚基上抑制位点Tyr15（Y15）残基磷酸化，抑制MPF活性，第二种蛋白激酶是Cdc2活化蛋白激酶（CAK），可以使Cdc2蛋白亚基中激活型的关键位点Thr15残基是磷酸化，这种磷酸化最大限度地激活了MPF的活性；但是，只要Tyr15残基磷酸化的，Cdc2-Cdc13复合物就没有活性。这种无活性的MPF称为前MPF。要使MPF具有活性，需要Cdc25蛋白的作用。该蛋白具有蛋白磷酸酶的活性，能够将Try15的磷酸基团去除从而将MFP激活，诱导细胞从G2期进入M期。 6.细胞周期关卡 6.1.细胞周期中的3个主要关卡 在典型的细胞周期中，控制系统是通过细胞周期的关卡进行调节。控制系统至少有3个关卡：G1关卡（靠近G1末期）、G2关卡（G2期结束点）、中期关卡（在中期末）。在每一个关卡，由细胞所处的状态和环境决定细胞能否通过此关卡，进入下一阶段。 G1关卡 主要是监测细胞的大小和环境状态，如果条件适合，就会激发DNA复制，使细胞周期的进程向前移动。一些真核生物中，G1关卡是细胞周期的主要控制点，它决定着细胞能否分裂。至少涉及6个基因，其中一个基因是所有真核细菌生物中都具有的，是控制细胞周期的关键，它参与对M期的控制。 如果细胞被阻止在G1期，可能会产生两种结果：一种是暂时停止生长，使G1期延长，直到条件适合时再通过。另一种可能是使细胞进入G0期，处于暂时静息状态。某些调控蛋白要暂时降解，使细胞不分裂。静息的G0细胞要进入G1期，必须受到某些分裂原的刺激（分裂原或是外部的或内部合成的）。然后合成某些必要的调控蛋白。某些静息的细胞不能进入G1期。还有一个关卡就是DNA预复制的阻断，为了保证每一条DNA在细胞周期中只复制一次，一旦DNA进行了复制，细胞就会通过对预复制复合物的装配控制DNA的再复制，就会进入有丝分裂。 G2关卡 当细胞周期进行到G2关卡时，控制系统检测细胞的大小、细胞所处的状态以及细胞内DNA是否复制完毕，如果这些条件适合，就会进入优势分裂。 中期关卡 控制系统检测所有的染色体是否都与纺锤体相连，并排列赤道板上；否则不能进行有丝分裂和胞质分裂。 6.2.其他影响细胞周期的事件 ① DNA复制不完全 没有将所有的染色体都复制的细胞不能进入有丝分裂。这种关卡的控制作用涉及未复制DNA的识别和MPF活性的抑制。 ② 纺锤体的装配不正常 秋水仙素的作用是抑制微管的聚合、抑制有丝分裂纺锤体的装配，从而抑制细胞分裂，这说明在细胞周期中纺锤体装配是否正常也是一种关卡。 ③DNA损伤 如果细胞中的DNA的UV、γ射线或化学修饰等引起的损伤，细胞也会被阻止在G1期或G2期，直到受损伤的DNA被修复。 |
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