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题目：Regulatory NADH dehydrogenase-like complex optimizes C4 photosynthetic carbon flow and cellular redox in maize 刊名：New Phytologist 作者：Qiqi Zhang, Peng Wang et al. 单位：CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Shanghai, 日期：23 October 2023    01 摘要  C4植物通常调控从叶肉（M）细胞到束鞘（BS）细胞的CO2浓缩机制。NADH脱氢酶样（NDH）复合物在许多NADP-苹果酸酶（ME）型C4植物的BS细胞中富集，并且在C4中比在C3植物中更丰富，但它在多大程度上参与CO2浓度机制仍有待实验研究。 我们创造了NDH功能缺陷的玉米和水稻突变体，然后结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学方法进行比较分析。 在玉米中观察到生长、光合活性和关键光合蛋白水平显著下降，但在水稻突变体中没有观察到。然而，在玉米突变体中，许多循环电子传输（CET）和Calvin–Benson循环成分以及BS特异性C4酶的转录物丰度增加。玉米ndh突变体的代谢产物分析显示NADPH增加 : NADP比率，以及苹果酸、1,5-二磷酸核酮糖（RuBP）、1,6-二磷酸果糖（FBP）和光呼吸中间体。 我们认为，通过优化NADPH和苹果酸水平并调节NADP-ME活性，NDH的作用是平衡玉米BS细胞的代谢和氧化还原状态（除了ATP供应），协调光合转录物丰度和蛋白质含量，从而直接调节玉米双细胞C4系统中的碳流。 02 技术路线  Maize (Zea mays ssp. mays KN5585) plants Blue native (BN)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and Western blot Monitoring chlorophyll fluorescence and P700 redox Transmission electron microscopy Mass spectrometry analysis of protein samples western blot Metabolite profiling 03 主要结果 3.1 玉米和水稻叶绿体NDF6和NDHU亚基缺陷突变体的构建 NDH在结构上分为五个子复合体：A、B、M（膜）、L（管腔）和ED（电子供体）。亚复合物B由五个亚基（PnsB1-5）组成，对叶绿体NDH具有特异性。通过数据挖掘，我们发现玉米BS细胞中NDF6（最近被命名为PnsB4的基因）和NDHU（NDHU属于亚复合体ED）的转录丰度高于M细胞，玉米叶片中NDHU的转录丰度也高于水稻叶片。NDF6、NDHN和NDHO的转录水平在水稻叶片中具有相对可比性。 为了剖析和比较NDH介导的CET在C4和C3光合作用中的意义，我们使用CRISPR-Cas9技术产生了玉米和水稻NDF6和NDHU亚基的功能缺失突变体。对于玉米ndh突变体，分别为ZmNDF6和ZmNDHU基因第一外显子的近50个末端序列设计了两个sgRNA，以构建基因编辑载体。获得了7株ZmNDF6编辑的玉米植株和5株ZmNDAHU编辑的玉米株。ZmNDF6基因中有49、51和54bp纯合缺失（从ATG后16bp开始）的三个品系分别命名为ZmNDF6-1、ZmNDF6-2和ZmNDF6-3。ZmNDHU中的两种纯合突变类型（ZmNDHU-1和ZmNDHU-2）也被鉴定。 对于水稻ndh突变体，分别设计OsNDF6基因第三外显子和OsNDHU基因第一外显子50末端附近的单个sgRNA来构建基因编辑载体。获得了12个OsNDF6编辑的水稻植株，包括3个具有3或10bp缺失或单碱基插入的OsNDF6纯合系。它们分别被命名为osndf6-1、osndf6-2和osndf6-3。对7个OsNDHU编辑的样本进行测序，但发现所有T0植物都是杂合的。分离后，我们鉴定了具有单个a碱基插入或163bp缺失的纯合osndhu突变体，并将其分别命名为osndhu-1和osndhu-2。 通过蛋白质印迹分析突变体和野生型之间NDH蛋白组分的变化。正如预期的那样，NDF6亚基在zmndf6的叶片中几乎检测不到（图1e），而zmndhu中的NDHU亚基几乎无法检测到（图1f）。玉米ndh突变体中NDHH、NDHS和NDHO亚基的蛋白质水平也降低（图1e，f）。这些亚基的减少可能也影响了NDH-PSI超复合体的数量和组装，如凝胶和二维电泳所反映的（图1i，j）。通过检测PSI、PSII、细胞色素b6f和ATP合酶的亚基，我们发现在zmndf6中PsaA而不是PsaD亚基的蛋白质水平倾向于低于WT，而在zmndhu中PsaD而不是Psa亚基的蛋白水平倾向于比WT低，而细胞色素b6f复合物的PetA亚基和ATP合酶的AtpB亚基与WT的没有显著差异。在水稻osndf6和osndhu突变体中，测试的NDH亚基的蛋白质水平也显著降低（图1g，h），但与玉米突变体中的情况相比，与PSI、PSII、细胞色素b6f和ATP合酶相关的蛋白质水平在水稻突变体中没有显著变化。
3.2 ndf6和ndhu突变体在玉米中的生长受到抑制，但在水稻中没有，尽管两者的循环电子流都减少了 在人工栽培室中培养T1植物30天后，与野生型玉米KN5585相比，zmndf6和zmndhu突变体的生长受到抑制（图1a）。zmndf6和zmndhu突变体的叶片叶绿素含量和株高显著低于野生型（P<0.01）（图1b）。T1植物在田间温室中30天后的黄叶颜色比在人工栽培场中更明显。在ndhn和ndho的玉米转座子插入突变体中也观察到生长较慢和色素水平降低。然而，与野生型ZH11相比，水稻osndf6和osndhu突变体在生长和叶绿素含量方面没有明显差异（图1c，d）。 与WT相比，玉米zmndf6和zmndhu突变体中叶绿素荧光的光照后增加消失，表明CET的活性受到抑制（图2a）。在玉米的ndhn和ndho突变体中也发现了类似的结果，尽管照射后的增加并没有完全减少。此外，突变体在光下的叶绿素荧光诱导曲线的下降速度比WT慢，表明电子传输链处于过度还原状态。远红光引起810–830 nm吸收的增加（P700的氧化），并且PSI周围的CET活性部分反映为关闭远红光后光吸收的减少（P700+的减少）。zmndf6和zmndhu突变体中P700+的暗还原率显著低于WT（P<0.01或<0.05）（图2b），表明CET部分失活。在水稻osndf6和osndhu叶片中，与野生型相比，osndf6和osndhu-突变体中叶绿素荧光的光照后增加减少（图2a），但（与玉米不同）在光化光下叶绿素荧光的下降阶段没有重大差异。与野生型相比，osndf6和osndhu突变体的P700+还原率不同程度地降低（图2b）。这些结果表明，在水稻NDH缺乏突变体中，CET途径的活性也受到阻碍。
图2玉米和水稻ndh突变体的光系统I（PSI）循环电子流均降低，但其他光反应参数变化不同。 （a） NDH循环电子传输（CET）活性的测量 （b）P700+的再还原发生在关闭FR光后，计算WT和NDH突变体之间P700+再还原的初始速率 （c–f）玉米的光合光反应参数显著降低，而水稻ndh突变体则没有。 3.3 玉米的光合作用光反应和CO2同化严重受损，而水稻NDH缺乏突变体则没有 为了探讨NDH缺乏的C4和C3植物的光合活性是否以及在多大程度上受到影响，我们测试了玉米和水稻突变体的CO2响应曲线（A/Ci）、电子转移速率（ETR）、非光化学猝灭（NPQ）和其他光合参数。研究发现，玉米zmndf6和zmndhu突变体中的A/Ci曲线的初始斜率和稳态光合速率水平明显低于玉米WT（图3a，b），zmndf6和zmndhu突变体的ETR和NPQ水平也是如此（图2c，d）。与这些观察结果一致，据报道，玉米的ndhn和ndho突变体的稳态光合速率和光保护NPQ降低。在水稻osndf6和osndhu突变体中，A/C曲线的初始斜率和稳态光合速率水平与WT没有显著差异（除了osndf6突变体的A/C曲线似乎低于WT；图3c，d）。ETR和NPQ的测量也显示水稻ndh突变体和WT之间没有显著差异（图2e，f）。值得注意的是，虽然zmndf6和zmndhu突变体的气孔导度（gs）与WT没有差异，甚至更低，但细胞间CO2浓度（Ci）增加（图3e、f）。这意味着CO2同化被抑制，但这不是由于气孔限制。水稻ndh突变体的气孔导度和细胞间CO2浓度变化不明显（图3g，h）
图3玉米的CO2同化受到严重抑制，而水稻ndh突变体则没有。 （a–d）在1200 lmol光子m 2 s 1和28°C下测得的净光合同化率 （e–h）在28°C和400 lmol CO2 mol 1下测量的气孔电导（gs）和细胞间CO2浓度（Ci） 3.4 玉米ndf6和ndhu突变体叶绿体超微结构异常及ROS积累 为了探讨玉米BS叶绿体NDH-PSI蛋白复合物的数量和完整性与类囊体片层结构之间的关系，对玉米WT和zmndf6叶片样品进行了透射电子显微镜观察。与野生型相比，非包装基质类囊体在玉米zmndf6突变体的BS叶绿体中的组装较少，并且观察到具有间歇性分布甚至不存在片层的区域（图4a、b、e、f）。对于M细胞叶绿体，与WT相比，zmndf6突变体中基粒类囊体的厚度降低，基粒片层没有很好地排列（图4c，d，g，h）。此外，突变体中BS细胞的淀粉颗粒积累低于WT（图4a、b、e、f）。据此，在叶石蜡切片中通过I2–KI进行的淀粉染色显示，ndh突变体中当天早期合成的淀粉量和当天晚些时候的积累量都低于WT（图4j）。淀粉含量的降低可能与玉米ndh突变体的光合活性降低有关（图3）。造成叶绿体超微结构受损的原因之一可能是玉米ndh突变体遭受的潜在光氧化应激，NPQ能力的降低也表明了这一点（图2c，d）。我们通过与H2O2反应的3,3-二氨基联苯胺（DAB）染色检测了BS和M细胞中活性氧（ROS）的积累（图4i）。在zmndf6和zmndhu突变体的BS叶绿体中密集地表现出棕色信号，在相邻的M叶绿体中也可见棕色染色。在WT中，总体染色强度远低于ndh突变体（图4i）。这些结果表明，当玉米叶片中NDH缺乏时，BS和M细胞中的ROS积累增加。
图4玉米ndh突变体叶片中叶绿体结构异常以及活性氧（ROS）和淀粉的积累。 （a–h）玉米zmndf6突变体束鞘（BS）和M叶绿体的异常类囊体超微结构。显示了野生型（WT）中BS叶绿体（a，b）、WT中M叶绿体（c，d）、zmndf6中BS叶绿体的透射电子显微照片（e，f）和zmndf6中M叶绿体的透射电镜显微照片（g，h）S’表示淀粉颗粒。白色三角形指向基质类囊体的断裂末端。 （i） 3,30-二氨基联苯胺（DAB）染色的横断面显示玉米zmndf6和zmndhu突变体的BS细胞中ROS的过量产生。 （j） 横断面的光显微照片显示玉米zmndf6和zmndhu突变体叶片中淀粉颗粒较少。 3.5 NDH缺乏对BS细胞蛋白质组的影响 为了进一步探索NDH缺乏对玉米BS细胞的特异性影响，我们通过比较WT和zmndf6突变体的分离BS细胞进行了蛋白质组学分析。首先，对BS制剂的纯度进行了评价。正如预期的那样，蛋白质印迹分析显示RbcL在BS而不是M制剂中富集，而PPDK的分布模式相反。从蛋白质组学数据中，我们发现许多NDH亚基（包括NDHU、NDHM、NDHN、PnsB1和PnsL2）的含量显著降低，而PGR5和PGRL1的含量变化较小，证实ZmNDF6的突变降低了玉米BS细胞中NDH复合物的丰度（图5a）。BS特异性C4酶NADP-ME和Rubisco激活子（尤其是RCA2）的含量增加（图5a，b），而Rubisco亚基的含量在测试品系中没有显著变化（来自BS细胞和整片叶片）。 有趣的是，果糖二磷酸醛缩酶（SFBA）含量增加，而果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）含量下降（图5a）。对参与淀粉代谢的蛋白质的进一步分析显示，β-淀粉酶（BAM9）是叶片淀粉降解的非酶调节因子，显著上调。这也可能与玉米ndh突变体中淀粉含量的降低有关（图4j）。此外，在zmndf6突变体中，与PSI复合物相关的蛋白质显著较少（P<0.01或<0.05）。由于PSI和NDH形成超复合体，因此zmndf6突变体中NDH复合体的缺乏似乎也会影响PSI蛋白的丰度。ATP合酶的成分似乎是稳定的，而与Cytb6/f复合物相关的成分（例如PetA、PetD和PetC）在zmndf6-BS细胞中减少。值得注意的是，STN7和STN8（参与状态转换），以及铁氧合酶NADP+还原酶1（FNR1）和FNR3（负责NADPH和铁氧还蛋白之间的电子传输），在zmndf6 BS细胞中显著上调（P<0.01），表明光能和电子流的分布发生了大的变化。对与氧化还原调节相关的蛋白质变化的分析显示，硫氧还蛋白和过氧化物酶显著下调（P<0.01或<0.05），表明ZmNDF6的缺失严重影响了玉米BS细胞中的氧化还原环境。 总体而言，NDH亚基、BS特异性C4酶和PSI相关成分的蛋白质丰度显示出相似的趋势，尽管不同的样品处理和方法的敏感性可能导致蛋白质印迹和蛋白质组学之间的某些蛋白质不一致。
图5束鞘（BS）细胞特异性循环电子运输（CET）途径和CO2同化相关蛋白的变化。 （a） 根据束鞘（BS）细胞蛋白质组学的定量值，对玉米野生型（WT）和zmndf6突变体进行了比较。 （b） 免疫印迹分析显示，与WT相比，玉米ndf6突变体的BS细胞或整片叶片中Rubisco激活蛋白的量增加，RbcL蛋白的量变化相对较小（样品之间的相对量因批次而异，但趋势很明显）。 3.6 玉米ndh突变体中参与Calvin–Benson循环和循环电子运输的基因转录物丰度增加 在转录水平上，在RNA测序后，我们系统地分析了光合作用相关功能基因的差异转录积累，这些基因是从Friso等人提供的玉米光合蛋白的完整列表中转换而来的。通常，两个玉米ndh突变体中的转录物积累表现与水稻ndh突变体不同，与CET途径和Calvin–Benson循环相关的转录物丰度在玉米突变体中大多更高（图6）。在玉米zmndf6和zmndhu突变体中，参与LET的基因（如PSII、PSI、细胞色素b6f和ATP合酶）的转录物丰度显示出不同的变化。在两个玉米突变体中，编码LHCII-1.4和LHCII-1.5的基因的转录物丰度显著且均匀地下调（高达8.6倍）。上调的基因包括编码OEC23样氧进化复合物、PsbS和Rieske结构域蛋白的基因（图S6a，b）。 在玉米zmndf6和zmndhu突变体中，与Calvin–Benson循环和光呼吸相关的基因的转录丰度经常上调，尤其是Rubisco活化酶（RCA）和果糖二磷酸醛缩酶-2（SFBA-2）。一个例外是FBPase在两个玉米ndh突变体中都明显下调。相应地，与淀粉生物合成相关的基因的转录物丰度也显示出广泛的上调。在水稻osndf6和osndhu突变体中，Calvin–Benson循环或光呼吸相关转录物积累没有一致的上调，确实存在下调的趋势。 我们通过qRT-PCR验证了玉米zmndf6和zmndhu突变体中C4酶的转录丰度。与转录组数据一致，编码BS细胞定位的ME、RbcS和RbcL1的主要基因（在转录物中更丰富）的转录物丰度在zmndf6突变体中分别上调了2.27、4.26和4.35倍。相反，在zmndf6突变体中，M细胞定位的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）、苹果酸脱氢酶（MDH）和丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）的主要转录物丰度没有显著改变甚至降低（图6c）。类似地，在zmndhu突变体中观察到BS特异性C4基因的转录物丰度增加。由于叶绿体信号参与核质体通讯，叶绿体内由NDH缺乏引起的氧化还原变化（图4i）可能是这些转录物丰度变化的原因之一，这反过来可能影响BS中的蛋白质变化。
图6玉米ndh突变体中转录物丰度和束鞘（BS）细胞蛋白质含量的变化。 （a） 热图显示了ndh突变体中相对于其野生型（WT）的差异积累转录物。 （b） 由（a）中显著变化的基因编码的蛋白质的名称。 （c） RT-PCR验证显示玉米ndh突变体中BS而非M特异性C4基因的转录物积累增加 3.7 NDH-CET受损导致玉米光合碳代谢的关键变化 光合作用、转录物丰度和蛋白质含量的变化表明，NDH缺乏对玉米和水稻的CO2同化有不同的影响。因此，我们使用玉米和水稻叶片进行代谢分析，研究了NDH如何影响光合代谢。玉米zmndf6和zmndhu突变体的代谢谱彼此相对一致，具有明显的共同上调或下调成分（图7a）。具体而言，与野生型相比，玉米ndh突变体中参与Calvin–Benson循环的代谢产物通常减少，但1，5-二磷酸核酮糖（RuBP）和1，6-二磷酸果糖（FBP）除外，它们显著积累（P<0.01或<0.05；图7a，d）。相反，在玉米ndh突变体中，光呼吸早期阶段的代谢物增加（图7a，f），表明光呼吸增加，与之前在玉米ndhn和ndho突变体中的报道一致。对于C4代谢周期，我们发现磷酸烯醇丙酮酸盐（PEP）、丙酮酸盐（Pyr）和天冬氨酸盐（Asp）在不同程度上减少，而苹果酸盐在zmndf6和zmndhu突变体中都增加（图7a，e），这与NADP-ME的转录物丰度和蛋白质含量增加有关（图5a，6c）。苹果酸的变化可能也导致富马酸（Fum）的积累，富马酸在三羧酸循环（TCA循环）中与富马酸相互转换；图7g）。应该提到的是，许多代谢产物被划分为一个参与C4代谢的亚群，苹果酸就是一个例子。观察到的变化可能不仅发生在C4代谢中。在这个阶段，我们无法阐明BS细胞的代谢组学。我们计算了ATP:ADP、NADH:NAD和NADPH:NADP的比率，结果表明，野生型和玉米突变体中的ATP:ADP比率相似，而玉米的两个ndh突变体中的NADPH:NADP比率显著增加（P<0.01或<0.05；图7h）。NADPH:NADP的比例很重要，因为NADPH参与的几个反应是可逆的。水稻osndf6和osndhu突变体的代谢谱显示出更多的可变波动，但总体上含量呈下降趋势（图7b，c）。相反，当玉米ndh突变体中腺苷酸和NADPH的水平增加时，水稻ndh突变体的水平似乎降低或没有一致的变化（图7b，c）。
图7玉米NDH-CET的缺失导致关键的光合代谢产物受到干扰。 （a） 玉米zmndf6和zmndhu突变体中光合代谢产物的相对丰度（log2转化倍数变化）。 （b，c）水稻osndf6和osndhu突变体中光合代谢产物的相对丰度（log2转化倍数变化）。 （d）Calvin–Benson循环（Berg等人，2007） （e）C4代谢循环（从PEP到OAA到Asp的虚线箭头表示该途径在ndh突变体中的活性可能降低） （f）光呼吸途径和（g）EMP、PPP途径和TCA循环中关键代谢产物的示意图。 （h） NADPH:NADP、NADH:NAD和ATP:ADP的比率。 04 结论  如图8所示，NDH-CET对于优化玉米NADP-ME亚型物种的C4光合作用是重要的。NDH途径在C4植物中的重要性可归因于ATP供应和NADPH周转，以及苹果酸流量和NADPME活性的调节。 NDH功能的丧失导致代谢、氧化还原和其他调节失衡，特别是在BS细胞中，然后反馈影响光合转录物积累和蛋白质水平的协调。 研究推进了对玉米BS细胞中NDH富集的功能理解，为NDH-CET参与C4进化过程中的优化事件提供了支持，并有望启发人们重新考虑微调策略，以实现C4光合作用的工程化。
图8 NDH介导的循环电子运输（CET）在玉米C4光合作用中的意义示意图。 （a） 在野生型（WT）玉米的BS细胞中，苹果酸从M细胞输入，主要通过NADP-ME脱羧，释放CO2，同时产生NADPH。CO2和NADPH用于Calvin–Benson循环。一些NADPH可能通过富集的NDH复合物（与M细胞中的细红色箭头相比，粗红色箭头）参与维持PSI-CET（驱动ATP产生），从而形成从苹果酸到NADPH、从NADPH到PQ（通过FNR、Fd和NDH）以及从PQ到PSI（通过PC）或H2O（通过PTOX）的电子流，因为BS细胞中几乎没有PSII-LET。玉米BS细胞具有低水平的PSII，但为了节省位置并强调PSI的富集，我们在该图中没有显示BS PSII；从NADPH通过FNR到Fd的电子流是可逆的 （b） 与野生型相比，在玉米ndh突变体的BS细胞中，PSI-CET受到抑制（灰色细箭头），苹果酸和NADPH积累（红色），导致氧化还原失衡，CO2固定减少（蓝色），ROS积累增加，光呼吸增加。Calvin–Benson循环在玉米ndh突变体中受到抑制，这反映在许多代谢产物的减少，但RuBP和FBP的特异性积累。此外，由于苹果酸输入和NDH缺乏的共同作用，玉米NDH突变体的BS细胞出现过度还原的情况。氧化还原状态和代谢产物流动的改变可能会扰乱细胞环境，并对转录物和蛋白质积累模式产生影响 05 原文获取 原文链接： https://nph.onlinelibrary./doi/10.1111/nph.19332 PDF获取： https://www./h-nd-273.html |
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