微生物基因编辑服务

后基因组时代一项重要的任务是研究并挖掘基因的功能，微生物也一样，即使是模式大肠杆菌仍有一半以上的基因为未知功能。对微生物基因组进行遗传改造，是真正实现驾驭微生物，为我所用的必须步骤。

|   技术流程

CRISPR/Cas9介导的基因敲除/敲入

1. 根据敲除基因序列设计sgRNA序列，构建Cas9-sgRNA敲除载体;

2. 融合PCR扩增，获得重组修复模板（缺失目的基因部分序列）;

3. 将敲除载体和重组修复模板共同转染到细菌内;

4. Cas9-sgRNA复合体对目的基因进行切割，造成双链断裂（DSB）;

5. 细菌利用带有部分目的基因缺失的重组修复模板对DSB进行修复，获得目的基因敲除菌株。

Red重组介导的基因敲除/敲入

1. 根据敲除基因设计同源臂序列，构建敲除载体，将敲除载体转染到细菌内;

2. 在Red重组酶作用下，敲除载体与目的基因发生同源重组，目的基因被抗性基因替换，通过抗性基因富集敲除菌株。

              

|   应用范围

大肠杆菌	枯草芽孢杆菌	假单胞菌	肺炎克雷伯菌	金黄色葡萄球菌
酿酒酵母	乳酸菌	毕赤酵母	假丝酵母	曲霉属真菌

|   技术优势

(1) 独特的供体菌，不要求靶细菌具有用于插入突变筛选的抗生素抗性。

(2) 高效的供体菌接合系统，保证抗性质粒具有高的接合转移效率。

(3) 抗性载体为T线性化载体，可直接与纯化PCR产物连接，不需要考虑酶切位点，大大节省客户时间。

(4) 优化的抗性载体序列，最大化减少冗余区，从而提高接合转移效率，减少非特异重组的概率。

(5) 抗性载体具有自主开发的正向筛选基因Hygro，从而大大增加基于抗性载体基因敲除技术的适用范围，减少重组后突变克隆的筛选工作。

(6) 具有一系列不同抗性的质粒，保证具有某种抗性的靶细菌均有合适的抗性质粒使用。

|   案 例

1. 沙门氏菌基因敲除及回补实验

2. 大肠杆菌基因过表达

3. 酿酒酵母基因敲入