【原】你会做革兰氏染色吗？革兰氏染色关键点解析

食品微生物检测 2024-01-02 发布于山东

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革兰氏染色关键点解析

革兰氏染色是食品微生物检测过程中需要经常用到的染色方法，也是微生物检验员的基本功之一。通过革兰氏染色，可以了解目标细菌的革兰氏性状及菌体形状。

革兰氏染色法的原理

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙。因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差。在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍无色，再经沙黄等红色染料复染，就是革兰氏阴性菌呈红色。

但是在日常的染色过程中，经常遇到一些问题，导致革兰氏染色的结果不是特别理想，小编总结了一些革兰氏染色过程需要注意的关键点，供大家参考。

菌落的选择

在进行革兰氏染色时，我们需要使用新鲜的菌落样本，不能过度培养。常见细菌一般在营养琼脂平皿上生长24h为宜，个别生长缓慢的菌（如单增李斯特氏菌）可以培养48h。一般情况下不能使用超过48h培养的菌落。因为菌落培养时间过长，菌落里的细菌会慢慢处于衰亡期，此时细菌的活性较低，很容易出现假阴性的染色结果。同时，一般情况下也不会采用选择性平皿上的菌落进行染色，这也是由于选择性平皿中有抑菌物质，对目标菌有或多或少的抑制作用，也会导致染色结果出现错误。

菌量的控制及涂布

做革兰氏染色的第一个关键点是控制菌量。如果用于染色的菌太少，那么在染色结束后的显微镜观察环节，视野下的菌不易寻找，或根本找不到菌；而取的菌量过多，会导致很多细菌细胞重叠在一起，存在染料无法充分染色所有的菌的情况，导致染色结果出现错误，同时密密麻麻的菌重叠在一起，也不利于镜检观察。

因此，在进行染色前，我们需要注意菌落的大小。一般情况下，如果平皿上生长的菌落为直径1mm，那么刮取一个菌落均匀的涂布到生理盐水上即可，如果菌落直径较大，可以刮取菌落的一部分进行涂布。同时在涂布时也应在生理盐水中充分研磨，使细菌和生理盐水能够充分的混合，形成均匀的菌悬液，避免菌落分布不均。

目标菌固定时的温度

在进行目标菌固定的过程中，我们需要特别注意水分的蒸发和菌膜的形成。当目标菌涂布均匀后，需要使水分充分蒸发后将目标菌固定在载玻片上，此时的操作是在酒精灯火焰上方，快速移动载玻片，利用载玻片移动时气流和酒精灯的加热，加速水分的蒸发。此时不可用酒精灯直接加热菌悬液液滴，只能在不断的移动中使水分蒸发，这个过程宁可耗时长一些，也不可直接进行加热。在液滴边缘出现蒸干的白色区域后，就可以不用酒精灯加热，利用载玻片上的余热，将剩余水分蒸干，形成一层薄薄的半透明白色菌膜。

染色和清洗时的操作

在进行染色时，务必要保证染色液完全覆盖整个菌膜，这样菌体才能够充分吸收各种染色液，并且需要严格的执行各种染料的染色时间，不要超时导致过度染色，也不能染色时间太短，导致染色不充分。在清洗时，也要使用流速比较缓慢的水流，避免水流直接冲击菌膜，致使菌膜从载玻片上脱落；冲洗后也应该用吸水纸将载玻片上的水分吸干，不能直接擦拭载玻片上的水分，避免意外将菌膜擦掉。